1、树胶脂毒素对体外培养的背根神经节神经元的影响作者：于振海 孙毅 张璐萍 阚氏海 刘蛟 黄飞 【摘要】 目的 观察树胶脂毒素对体外培养大鼠脊神经背根神经节神经元的影响。方法 对 Wistar 胎鼠背根神经节神经元行原代培养，采用100 nmol/L 浓度的树胶脂毒素对培养的神经元进行处理，运用 MTT 比色法和细胞形态学分析法，观察树胶脂毒素对神经元存活及形态的影响。结果 背根神经节神经元存活率降低，神经元呈簇状聚集明显，细胞轮廓增强，胞体缩小，突起断裂或变短甚至消失。结论 100 nmol/L 浓度的树胶脂毒素对背根神经节神经元有损伤作用。 【关键词】 树胶脂毒素；背根神经节；神经元 【Abs
2、tract】 Objective To observe the influence of resiniferatoxin on the dorsal root ganglion of rat.Methods The dorsal root ganglion cell culture model was found, disposed with the resiniferatoxin in the density of 100 nmol/L，and then use the method of MTT and observed the cells morphologic change.Resul
3、ts The resiniferatoxin reduce the survival of the cell.Cell gathered obviously,cell body became smaller,cell processes faulted or shortened or even disappeared.Conclusion The density of the 100 nmol/L resiniferatoxin can damage the dorsal root ganglion cells. 【Key words】 resiniferatoxin,dorsal root
4、ganglion,neuron 膀胱灌注辣椒辣素在临床上主要用于治疗下尿路症状（lower urinary tract symptom，LUTS） 。近年来辣椒辣素的类似物树胶脂毒素( resiniferatoxin，RTX)由于疗效好、副作用轻，逐渐取代了辣椒辣素。RTX 是从大戟色素体树脂中提炼出来的一种超强的，具有与辣椒辣素相似的生物学活性的物质，其通过与初级传入神经元上的辣椒素受体(vanilloid receptor 1,VR1)结合，引起膀胱传入纤维脱敏，从而减少感觉纤维的传入，发挥其对下尿路症状的治疗作用。虽然 RTX 在膀胱灌注治疗下尿路症状的临床应用中没有发现致癌或促进肿瘤生
5、长作用，但是其远期安全性仍然是未知的。 临床最关心的是 RTX 对膀胱的传入神经是否有损伤，传入神经的胞体位于脊髓背根神经节。为此，本研究利用体外建立胎鼠背根神经节神经元培养模型，采用临床膀胱灌注浓度的 RTX 对培养的背根神经节神经元进行处理，观察在此浓度下背根神经节神经元的存活率及形态学改变，从而探讨其对背根神经节神经元的影响，为临床应用 RTX 膀胱灌注治疗下尿路症状的用药安全性提供一定的理论及实验依据。 1 材料与方法 1.1 试剂和仪器 DMEM/F12 培养基,胎牛血清均购自 GIBCO 公司, 树胶脂毒素（resiniferatoxin，RTX）购自美国 LKT 公司，MTT、多
6、聚赖氨酸购自 Sigma 公司，Olympus CKX41 型倒置相差生物显微镜由滨州医学院形态学实验室提供。 1.2 DRG(背根神经节)神经元的培养 在无菌条件下,取胚龄为 15 d 胎鼠 30 只,在解剖显微镜下取每只胎鼠的背根神经节,每只胎鼠可得到30 个左右的背根神经节。在解剖显微镜下,用显微外科镊子和手术刀移去神经节外膜和神经根。将除去神经节外膜的背根神经节移入含有 0.25%胰蛋白酶的离心管内 37水浴中消化, 2030 min 后加入含血清的培养液，以终止消化。用吸管吹打数次,使神经节组织块分散,用 200 目的尼龙网滤去细胞团块,将得到的细胞悬液离心 5 min(1 000
7、r/min),弃上清液,在离心管内加入适量培养液,用吸管轻轻吹打,制成均匀的细胞悬液,取样计数后用培养液调整细胞浓度为 3105 个细胞/l，种植在 24 孔（每孔加入 1l 细胞悬液）培养板内涂有多聚赖氨酸的圆盖片上，标上细胞名称、组号和接种日期等。将标本移入 37、5%CO2 培养箱内孵育。 1.3 细胞分组和处理 上述培养的 DRG 神经元,于 37、5%CO2 及饱和湿度条件下培养 48 h 后随机分组如下:正常对照组：原代培养的DRG 神经元培养 48 h，然后加入 50 l 无菌去离子双蒸水孵育 12 h，作为正常对照；实验组: 将原代培养的 DRG 神经元培养 48 h，然后用1
8、00 nmol/L 浓度的树胶脂毒素孵育 12 h。 1.4 观察细胞形态 24 孔板培养的 DRG 神经元,于培养后 48 h 及随机分组、RTX 处理 12 h 后，置倒置显微镜下观察细胞形态,并取视野中细胞较明显处照相。 1.5 MTT 法检测细胞的存活率 25 mg MTT 溶于 pH7.4 PBS 液 5 ml中，过滤除菌。将各组神经元以每孔 100 l 传于 96 孔培养板。在终止培养前 4 h，各组分别加入 20 l 5mg/ml 的 MTT 溶液。吸弃培养液，各孔加入 100 l DMSO，将培养板振荡 1020 min。将培养板放在酶联仪上，采用实验波长 570 nm，参考波
9、长 630 nm，测定光密度（OD 值） ，各组 OD 值取均值后，以下列公式计算存活细胞百分数：存活细胞%（OD实验/OD 对照）100%（以空白组 OD 值调零） 。 2 结果 2.1 光镜观察结果 相差显微镜下,培养 48 h 的 DRG 神经元呈单层散在分布，神经元数目较多，形态较小,有突起,呈球形、椭圆形或不规则形，有少量较小的突起，细胞一般独立生长（图 1） 。继续培养 12 h 后神经元胞体变成多边形或多角形，生长出较长的突起，突起互相交织形成网状联系，DRG 神经元贴壁良好，镜下折光性较好，形成了神经元样细胞（图 2） 。采用 RTX 孵育 12 h 后的 DRG 神经元折光性
10、变弱，细胞贴壁不良, 有部分细胞脱壁，神经元样细胞呈簇状聚集明显，细胞轮廓增强，胞体缩小，神经元胞体回缩形成圆形，突起断裂或变短甚至消失，神经突起相互交织形成的网络受到破坏，细胞表面变得粗糙，胞体皱缩，胞内可见颗粒状物质，部分细胞脱落形成悬浮细胞，细胞数目减少（图 3） 。2.2 MTT 法检测细胞存活率 树胶脂毒素孵育组 DRG 细胞存活率（20.057.11）%，与对照组比较有显著性差异（P0.05） 。 3 讨论 下尿路症状是指尿频、尿急、急迫性尿失禁和排尿困难等与下尿路相关的症状的统称，临床表现主要有膀胱过度活动、非梗阻性尿潴留、尿频尿急综合征。目前通过膀胱灌注药物来治疗 LUTS 越
11、来越引起医学界关注，特别是近年来由于 RTX 疗效显著、副作用轻，被广泛应用于 LUTS的治疗，如低顺应性膀胱、膀胱痛、间质性膀胱炎等。 RTX 是从大戟类树胶植物的乳汁中分离出来的一种超强的辣椒素的同源物，其具有与辣椒素相似的生物学活性。辣椒素类药物能选择性抑制痛觉神经,而对正常的触压觉、本体感觉和运动神经无影响,因此被认为是一种高选择性的镇痛药物1 。辣椒素类药物选择性作用的基础是辣椒素受体2(vanilloid receptor 1,VR1)。辣椒素受体仅表达于两种痛觉神经元:C 纤维神经元和型 A 纤维神经元3 。辣椒素类药物因剂量和用药方式不同对痛觉神经有 3 种效应: 兴奋、脱敏和
12、神经毒4 。RTX 用于膀胱内灌注治疗 LUTS,其机制是抑制 C 类神经和尿路上皮的 VR15 。以往研究表明，大剂量使用辣椒素是有毒性的, 可以引起传入神经中的 C 纤维变性、减少。体外细胞培养实验也表明, 高浓度的辣椒素对细胞有细胞毒性和遗传毒性作用6 。RTX 膀胱内灌注治疗膀胱逼尿肌过激疼痛, 能选择性地与初级传入神经元上的辣椒素受体结合，产生与辣椒素相似的疗效, 但无局部激惹症状7 。RTX 与辣椒素相比具有明显的优点8，9：用 0.01 mol/L RTX 便具有效果，最大量用至0.1 mol/L 并不给病人造成任何明显伤害；而且 RTX 作用的持续时间比辣椒素长，用 RTX 处
13、理后膀胱炎性变化恢复较快。RTX 的作用强度比辣椒素高 1 000 倍，并且在一定的用药剂量范围内没有辣椒素样的副作用。在某些病人，用辣椒素后具有导致自主神经反射功能消失的危险性，但应用 RTX 到目前为止尚未观察到这种现象，因此 RTX 已逐渐取代了辣椒素的应用。 RTX 的灌注剂量及浓度目前并无统一标准，临床常用的方式主要是：膀胱灌注 RTX 溶液 100 ml，一般浓度为 10100 nM/L 之间。膀胱灌注RTX 治疗 LUTS 的临床应用中尚未发现 RTX 的致癌或促进肿瘤生长的相关报道，但是其远期安全性仍然是未知的。 膀胱传入神经的胞体位于脊髓背根神经节。背根神经节被称为功能性脊柱
14、单位的“大脑” 。许多神经多肽在背根神经节神经元内合成，如果RTX 对背根神经节有大的损伤，那将导致病人极大的痛苦，并直接影响到膀胱灌注 RTX 治疗 LUTS 的前途。为此，本研究利用体外建立胎鼠背根神经节神经元培养模型，采用膀胱灌注 RTX 治疗 LUTS 的临床最大浓度对培养的背根神经节神经元进行处理，观察在此浓度下背根神经节神经元的存活率及形态学改变，从而探讨其对背根神经节神经元的影响，为临床应用 RTX 膀胱灌注治疗下尿路症状的用药安全性提供一定的理论及实验依据。 实验结果表明，采用 RTX 孵育后的 DRG 神经元折光性变弱，细胞贴壁不良, 有部分细胞脱壁，神经元样细胞呈簇状聚集明
15、显，细胞轮廓增强，胞体缩小，神经元胞体回缩形成圆形，突起断裂或变短甚至消失，神经突起相互交织形成的网络受到破坏，细胞表面变得粗糙，胞体皱缩，胞内可见颗粒状物质，部分细胞脱落形成悬浮细胞，细胞数目减少，MTT法检测表明细胞存活率也明显下降。可见 RTX 对培养的胎鼠背根神经节神经元具有一定的损伤作用。 本研究仅在分散培养的神经元中观察到了细胞突起的改变，但神经细胞究竟受到何种程度的影响，还需要进一步用定量的方法进行研究。RTX 对神经细胞影响的机制也需要对其超微结构以及细胞内各种受体的改变等多方面进行探讨，这些都有待于我们今后做更深入的研究。 【参考文献】 1 Karai L , Brown D
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