鼠心肌成纤维细胞NOS活性的变化和AVP对NO合成的影响.doc

1、鼠心肌成纤维细胞 NOS 活性的变化和 AVP 对 NO 合成的影响作者：范延红 赵连友 王士雯 郑强荪 徐琳 杨学东 田建伟 张海涛 【关键词】 成纤维细胞 关键词: 心肌;成纤维细胞;一氧化氮合酶;一氧化氮;精氨酸升压素 摘 要:目的 探讨在基础状态和精氨酸升压素（AVP）干预下，心肌成纤维细胞（CFs）一氧化氮合酶-一氧化氮（NOS-NO）系统活性的变化. 方法 胰酶消化法分离、培养新生 SD 大鼠 CFs，采用硝酸还原酶法和分光光度法分别测定基础状态和 AVP 干预下 CFs 的 NOS 活性和 NO 含量. 结果 基础状态下 CFs 的 36h 组 NO 含量（425）mol L-1

2、 和 NOS 活性（61783）kat L-1 ，显著高于 6h 组（143）mol L-1 ， （16767）kat L-1 .AVP 干预下 36h 组 NO 含量（621）mol L-1 和 NOS 活性（1150100 ）kat L-1 也显著高于 6h 组（344）mol L-1 ， （60033）kat L-1 ，且 AVP 干预组的 NO 含量和 NOS 活性均高于同时间点基础状态组（P0.05）.CFs 的 NO 含量和 NOS 活性随 AVP 浓度的增高而增加，其中 10-6 mol L-1 AVP 组（636）mol L-1 ， （110050）kat L-1 和 10-7

3、 mol L-1 AVP 组（696）mol L-1 ， （120050）kat L-1 都显著高于对照组（295）mol L-1 ， （45083）kat L-1 ，10-9 mol L-1 AVP 组（322）mol L-1 ， （500133）kat L-1 和 10-8 mol L-1 AVP 组（372）mol L-1 ， （60067）kat L-1 （P0.05）.不同浓度 AVP 干预下 NO 含量随 NOS 活性增强而增高，二者呈显著正相关（r=0.964，P0.01）. 结论 AVP 能提高 CFs 的 NOS-NO 系统活性，而拮抗 AVP 的促 MF 作用. Keywo

4、rds:cardiomyoplasty fibroblasts;nitric oxide syn-thase;nitric oxide;arginine vasopressin Abstract:AIM To investigate the changes of nitric oxide synthase-nitric oxide（NOS-NO）system activity in rat car-diac fibroblasts（CFs）with and without arginine vasopressin（AVP）treatment.METHODS CFs were isolated

5、by trypsin digestion method.Nitric acid reductase method and spec-trophotometry were used to detect the NO contents and NOS activity in AVP group（with AVP treatment）and control group without AVP treatment respectively.RESULTS NO contents（425）mol L-1 and NOS activity at36h（61783）kat L-1 were higher t

6、han those at6h（143）mol L -1 ， （16767 ）kat L-1 in control group.NO contents（622）mol L-1 and NOS activity at36h（1150100）kat L-1 were also higher than those at6h（344）mol L-1 ， （60033）kat L-1 in AVP group.NO contents and NOS activity of AVP group were both higher than those of control group（P0.05）.NO co

7、ntents and NOS activi-ty increased in a dose-dependent manner in AVP group.NO contents and NOS activity under10-6 mol L-1 AVP treat-ment（636）mol L-1 ， （110050）kat L-1 and under10-7 mol L-1 AVP treatment（696）mol L-1 ， （120050）kat L-1 were both higher than those of control group（295）mol L-1 ， （45083）k

8、at L-1 ，those under10 -9 mol L-1 AVP treatment（322）mol L-1 ， （500133）kat L-1 and those under10-8 AVP treatment（372）mol L-1 ， （60067）kat L-1 （P0.05）.NO contents increased with the enhancement of NOS activity with differ-ent concentrations of AVP，and there was significant positive correlation between

9、them（r=0.964，P0.01 ）.CONCLUSION AVP increases NOS-NO system activity in neonatal rat CFs.The enhancement of NOS-NO system ac-tivity could inhibit myocardial fibrosis induced by AVP. 0 引言 一氧化氮（NO）生成增多可舒张血管，降低血压，抑制高血压心肌纤维化（MF）的发生和发展.精氨酸升压素（AVP）收缩血管和抗利尿，并参与高血压的发生发展，促进 MF1 .血浆 AVP 水平的慢性升高可提高肾髓质 NOS 蛋白的表

10、达，使肾髓质 NO 浓度持续性升高，以维持心血管系统生理功能的平衡2 .但是，有关鼠心肌成纤维细胞（CFs）的一氧化氮合酶-一氧化氮（NOS-NO）系统活性的变化及其与 AVP 的关系还不清楚.我们以 SD 鼠 CFs 为研究对象，观察 AVP 干预下 CFs 的 NOS-NO 系统活性的变化，探讨 MF 的发生机制，对其防治提供新的思路. 1 材料和方法 1.1 材料 23d SD 仔鼠（第四军医大学实验动物中心提供）.含酚红 DMEM 培养液由 Gibco 公司提供，无酚红 DMEM 培养基由 Hyclone 公司提供，胰蛋白酶由华美公司提供.小牛血清由杭州四季青公司提供.AVP 由美国

11、Peninsular Lab 提供.NO 含量和 NOS 活性测定试剂盒由南京建成生物技术研究所提供. 1.2 方法 无菌条件下取 SD 仔鼠心室部分，无菌盐水漂洗后，剪至23mm2 小块，1.25g L-1 胰蛋白酶 37消化 2040min，每 5min 收集1 次细胞，将所得细胞置于含 100mL L-1 小牛血清的 DMEM 培养液中，37，50mL L-1 CO2 孵箱中贴壁，差速贴壁法去除心肌细胞，细胞长至近融合状态时传代.对 CFs 进行 SABC 法免疫组织化学染色:纤维连接蛋白染色阳性，血管平滑肌肌动蛋白染色阴性，符合 CFs 染色特征.实验用23 代细胞.将生长至融合状态的

12、 CFs 消化成单个细胞悬液，以 3000 个/孔接种于 96 孔培养板，每孔 200L，培养至近融合状态时，无血清DMEM 培养液驯化 24h，分别加入培养液和不同浓度 AVP，孵育预定时间.实验分为对照组、10-9 mol L-1 AVP 组、10-8 mol L-1 AVP 组、10-7 mol L-1 AVP 组和 10-6 mol L-1 AVP 组.其中对照组和 10-7 MAVP 组分别测定 6h 和 36h 的 NO 含量和 NOS 活性.细胞取自同批培养的 CFs. 1.2.1 细胞培养液 NO 含量测定 用硝酸还原酶法，检测细胞培养液中的 NO2- 含量，通过显色深浅读取吸

13、光度，测定其浓度的高低.样品 NO含量以公式（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）100mol L-1 计算. 1.2.2 细胞 NOS 活性测定 通过 NOS 催化产生的 NO 量推算 NOS 的活力.NO 与亲核物质生成有 色化合物，测定其吸光度值可计算出 NOS 活力.NOS 活性以每分钟生成的 NO 量表示，用公式（测定管吸光度-空白管吸光度）2360kat L-1 计算.统计学处理:数据以 x s 表示，应用 SPSS统计软件进行 t 检验，单因素方差分析和直线相关分析. 2 结果 2.1 AVP 干预下 CFs 的 NOS 活性和 NO 含量 在基础状态，C

14、Fs 培养36h 的 NOS 活性（61783）kat L-1 和 NO 含量（425）mol L-1 显著高于 6h（16767）kat L-1 ， （143）mol L-1 （P0.05）.10-7 mol L-1 AVP 干预下，CFs 培养 36h 的 NOS 活性（1150100）kat L-1 和 NO 含量（621）mol L-1 也显著高于6h（60033）kat L-1 ， （344）mol L-1 （P0.05）.在相应时间点，10-7 mol L-1 AVP 干预下 CFs 的 NOS 活性和 NO 含量都显著高于基础状态（P0.05）.不同浓度 AVP 干预 CFs24

15、h 后，NO 含量逐渐升高，呈剂量依赖性.其中 10 -7 mol L-1 AVP 组（696 ）mol L-1 和 10-6 mol L-1 AVP 组的 NO 含量（636）mol L-1 显著高于对照组（295）mol L-1 ，10-9 mol L-1 AVP 组（322）mol L-1 和 10-8 mol L-1 AVP 组（372）mol L-1 （P0.05）.10-6 mol L-1 AVP 组的 NO 含量虽略低于 10-7 mol L-1 AVP 组，但无显著差异（P0.05，Fig1）.不同浓度 AVP 干预 CFs24h 后，NOS 活性逐渐升高，呈剂量依赖性.其中

16、10-7 mol L-1 AVP 组（120050）kat L-1 和 10-6 mol L-1 AVP 组的 NOS 活性（110050）kat L-1 显著高于对照组（45083）kat L-1 ，10-9 mol L-1 AVP 组（500133）kat L-1 和 10-8 mol L-1 AVP 组（60067）kat L-1 （P0.05）.10-6 mol L-1 AVP 组的 NOS 活性虽略低于 10-7 mol L-1 AVP 组，但无显著差异（P0.05，Fig2）. 2.2 NO 含量与 NOS 活性的相关性 将不同浓度 AVP 干预 24h 的 NO 含量和 NOS

17、活性作相关分析显示:CFs 的 NO 含量随 NOS 活性的增强而增高，NO 含量与 NOS 活性呈显著正相关（r=0.964，P0.01，Fig3）. 3 讨论 MF 是高血压左心室肥厚的重要病理学特征，是以心肌细胞和间质胶原网络数量、质量发生改变为特征的心脏重构，尤其是心肌间质纤维化使心肌硬度增加，顺应性下降，导致心脏舒张功能障碍，是心力衰竭、心律失常发生的重要环节.CFs 是 MF 的主要效应细胞，CFs 增殖、胶原合成分泌过多是 MF 的主要病理基础.我们以 CFs 为研究对象，探讨 MF 的促进因素 AVP 和 MF 的抑制因素 NO 二者之间的相互关系.AVP 具有强烈的血管收缩作

18、用，能促进血管平滑肌细胞增殖3 ，参与高血压的发生和发展，高血压病患者血浆中 AVP 水平增高，其增高程度与高血压病严重程度相关.AVP 能够剂量依赖性地促进 CFs 增殖和胶原合成，促进 MF.NO可抑制 CFs 增殖和胶原合成4 ，自发性高血压大鼠 NOS 活性明显不足5 ，给自发性高血压大鼠输注 NO 的前体物质 L-精氨酸，可显著改善其 MF 的程度.在 AVP 作用下，体外培养的高血压病患者血管平滑肌细胞 NOS mRNA 表达量增高、NOS 活性增强，NO 含量增高6 .但是，AVP干预下 CFs 的 NOS-NO 系统活性的变化，目前尚不清楚. 图 1 不同浓度 AVP 干预 2

19、4h 的 NO 含量变化 略 图 2 不同浓度 AVP 干预 24h 的 NOS 活性变化 略 本研究表明，基础状态下体外培养的 CFs 具有 NOS 活性，能够产生一定量的 NO，且培养时间延长，NOS 活性增强，NO 含量增加.基础状态下的 NO 可拮抗循环和心肌组织局部 AgII 的致 MF 作用7，8 ，使正常心肌组织中的致 MF 因素和抗 MF 因素处于平衡状态.107 mol L-1 AVP 干预后，不同时间点的 NOS 活性和 NO 含量都显著增加.这说明，AVP 对 CFs的 NOS-NO 系统的活性有促进作用.文献报道，当心脏压力负荷增加时，心肌组织自身可产生 AVP9 .这

20、表明，当内环境变化使致 MF 的损伤因素加强时，CFs 能够自我保护性地上调抗 MF 因素，使致 MF 因素和抗 MF因素仍然处于平衡状态.本结果还显示，CFs 的 NOS 活性和 NO 含量随着AVP 浓度的升高和作用时间的延长而显著增加，表明 AVP 对 CFs 的 NOS-NO 系统活性的促进作用具有剂量和时间依赖性.鉴于 AVP 和 NO 对 MF 具有相互拮抗的作用，可以认为，AVP 诱导的 CFs 的 NOS-NO 系统活性增加可能属于生物体内的一种代偿性负反馈机制，以求最大限度地维持致 MF 因素和抗 MF 因素之间的平衡，保证心肌结构和功能的正常.但本研究也发现，当 AVP 浓

21、度从 10-7 mol L-1 再继续升高时，CFs 的 NO 含量不再继续升高.这说明，CFs 的代偿能力是有一定限度的.这时，如果致 MF 的损伤因素进一步加强，CFs 产生的 NO 将不能产生完全的拮抗作用，心肌组织肯定会向着 MF 的方向发展.本研究还发现，在各种不同浓度 AVP 干预条件下 CFs 的 NO 含量随着 NOS 活性的增强而增加，二者呈显著正相关.由此可知，CFs 的 NO 含量增加是由于 NOS 活性增强所致.NOS 活性增强的原因可能是 NOS 基因表达增加或 NOS 蛋白合成增多，但其确切机制还有待于进一步探讨. 图 3 不同浓度 AVP 干预条件下 CFs 的

22、NO 含量和 NOS 活性的相关性 略 参考文献: 1Yang XD，Zhao LY，Li X，Qiao HY.Effects of arginine vaso-pressin on collagen synthesis in rat cardiac fibroblasts J.Xin-zang Zazhi（Chin Heart J） ，2000;12（3）:169-171. 2Szentivanyi M，Park F，Maeda CY，Cowley AW.Nitric oxide in the renal medulla protects from vasopressin-indeuced

23、hyperten-sion J.Hypertension，2000;35（3）:740-745. 3Lu SP，Zhao LY，Li HW.Effect of antisense c-myc on the pro-liferation of vascular smooth muscle cells induced by arginine va-sopressin J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med U-niv） ，1997;18（3）:294-295. 4Kim NN，Villegas S，Summerour SR，Villarreal FJ

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