1、现代免疫分析技术及展望,湖北省临床检验中心黄 鹏,为什么要讲这个专题 ？ 目的是什么？ 想解决什么问题？,目前我省免疫分析技术在EQA检测方法上存在的主要问题 对所用仪器检测原理、所用检测方法不明确、不清晰。 方法编码填写错误，统计中出现分组不当等现象。,不适当的评价限及分组方法对能力验证/室间质评结果所造成的影响（以肿瘤标志物检测为例，适合内分泌检测）,一、湖北省肿瘤标志物能力验证/室间质评活动指定值（靶值）确定进程 自2007年始，依北京科临易检软件公司提供的室间质评软件，借鉴部临检中心对肿瘤标志物采用的相关评价方法，在指定值（靶值）确定上经历了如下进程：,二、不同类型检测试剂盒、仪器及实
2、验检测方法分组统计结果间的比较,三、湖北省肿瘤标志物检测能力验证/室间质评活动指定值（靶值）确定的发展趋势,对现代免疫分析技术进行系统性回顾尤为必要,何为免疫分析法？ 利用抗原抗体特异性结合反应检测标本中各种微量物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法。 特点：高特异性、高敏感性 随着标记技术的发展，现代免疫学技术发生了质的飞跃。,1941年，Coons等创立荧光素标记抗体技术； 1959年，美国学者Yalow和Berson建立了胰岛素的放射免疫分析技术； 1966年，美国和法国学者又同时报道建立了酶免疫测定技术； 20世纪70年代，出现了免疫浊度技术； 另一项重大突破是：1975年Ko
3、hler和Milstein建立的杂交瘤技术与单克隆抗体技术。,现代免疫分析主要包括： 荧光免疫、酶联免疫、免疫浊度、化学发光及流式细胞免疫等技术。 随着免疫标记技术、单克隆抗体技术、计算机技术的发展，实验室的免疫自动化成为现实。,免疫自动化使现代免疫检验具有： 准确、灵敏（可达10-17mol/L 以上） 快速（每小时可分析近200个测试） 高效（一份样品可同时检测数十个项目） 精密度（CV5%）、稳定等优点。 以下对现代免疫分析技术及仪器进行简单介绍。,一 、酶免疫分析（EIA） 利用酶催化底物，产生一系列生化反应，生成有色物的生物放大作用，提高抗原-抗体免疫反应的分析技术。 按是否需将已结
4、合的和游离的酶标记物进行分离，可将酶免疫分析技术分为： 均相和异相EIA（大部分标记免疫测定均属异相EIA。) 均相：一般是指底物与催化剂同时存在于同一体系中，比如说：溶液。 异相：一般是指底物与催化剂之间存在相界面，比如：吸附、固载、键合于高分子树脂链、水-有机两相反应等。,EIA具有:特异、敏感的优点，最低检测限为mg/L 水平。,（一）酶联免疫吸附试验（ELISA） 1、待检标本（抗体或抗原）与酶标记抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体发生特异免疫反应； 2、反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合，与待检抗体或抗原量成一定比例； 3、加酶反应底物后，底物可在酶作用下出现
5、颜色反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。,ELISA方法: 既特异又敏感。 应用此技术的自动化仪器设备包括： 罗氏公司: ES300、 Cobas Core（II） Bio-Rad 公司： CODA、EVOLIS,（二）微粒子酶免疫分析技术（MEIA） 反应最终形成微粒上包被的抗体-被测物-碱性磷酸酶标记的二抗夹心复合物，将其转移到玻璃纤维柱上，用缓冲液洗涤，再加入底物进行测定。 优点：灵敏度高、定量线性范围宽。 见于美国Abbott公司IMX与AXSYM全自动快速免疫分析系统。,（三） 酶促放大时间分辨荧光免疫分析（EATRF IA） 引入了时间分辨荧光免疫技术，有利于排除
6、特异荧光的干扰，并经酶促信号放大，增强了测量的特异性。 见于美国 M D 公司（Molecular Devices Corporation）的SPECTRA max GEMINI XS。,二、 免疫浊度分析 利用可溶性抗原、抗体在特定的电解质溶液中特异结合，形成一定大小的不溶的免疫复合物，使反应液出现浊度。 当反应液中保持抗体过剩时，随抗原量增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出样品的含量。,免疫浊度测定方法包括：透射比浊法、散射比浊法。 浊度法的优点： 校正曲线稳定 简便快速 易于自动化 无放射性核素污染。,（一） 透射浊度法（Turbidimetry） 1、抗原抗体
7、复合物，使介质浊度发生改变； 2、光线通过抗原抗体反应后的溶液，被复合物微粒吸收； 3、透射光被吸收的量（吸光度）与免疫复合物的量呈正相关； 4、测量透射光强度，与已知浓度的抗原对照，计算被检测溶液抗原的含量。 优点：合适的试剂，可在生化分析仪中作全自动分析。,（二） 散射浊度法（NepHelometry） 1、一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时遇到抗原抗体复合物微粒； 2、光线被微粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物大小、多少密切相关； 3、散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测物越多，形成的复合物越多，散射光强度越强； 4、仪器通过微电脑对测量数据自动分析处理，即可得知待测抗原的含量。 此原理研发的全自动分析系统有： Beckman-Coulter 公司：Array和Immage SIEMENS的 BN系列产品,三 、荧光免疫分析（FIA） 是抗原- 抗体结合反应与荧光物质发光分析相结合的免疫分析技术。 以双抗夹心法为例： 1、首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体； 2、除去未结合抗体，加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物； 3、洗涤除去未结合物，加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体-抗原-抗体复合物； 4、最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。,
