1、星形细胞肿瘤组织中核因子 B 的表达与肿瘤增殖作者：陈保东，袁先厚，江普查，陈卫国，文志华 【关键词】 星形细胞肿瘤 【Abstract】 AIM: To evaluate the significance of nuclear factor kappa B (NFB) p65 protein expression and their relationship with tumor proliferation. METHODS: The expression of NFB p65 protein, cyclin D1 protein and proliferating cell nuclear
2、 antigen (PCNA) protein in 64 cases of astrocytic tumors and 10 cases of normal brain tissue were studied immunohistochemically. RESULTS: None of the normal tissues exhibited NFB p65, cyclin D1 protein. In contrast, 35 of 64 astrocytic tumor specimens were positive for NFB p65 protein with a 54.7% p
3、ositive rate (P0.01), and 27 of 64 astrocytic tumor specimens were positive for cyclin D1 protein with a 42.2% positive rate (P0.01), the labeling index of PCNA protein were 2.2%-80.5%. Normal brain tissue were negative or of low expression for PCNA protein. The NFB p65 protein, cyclin D1 and PCNA p
4、rotein expression were correlated to the differentiation (P0.05).The expression of NFB p65 was closely related with the expression of cyclin D1 and PCNA. CONCLUSION: NFB p65 is a new oncogenic protein related to the astrocytic tumors. NFB p65 upregulates the expression of cyclin D1 and PCNA, then le
5、ads to tumor cell malignant proliferation and tumor occurrence. 【Keywords】 nuclear factor of kappa B(NFB); cyclin D1; proliferating cell nuclear antigen (PCNA); astrocytic tumor; immunohistochemistry 【摘要】 目的： 探讨核因子 B（NFB）在星形细胞肿瘤中的表达及其与肿瘤增殖之间的关系. 方法： 应用免疫组织化学方法检测NFB p65, cyclin D1 和 PCNA 在 64 例星形细胞肿瘤
6、组织及 10 例正常大脑组织中的表达情况. 结果： 星形细胞肿瘤中 NFB p65 蛋白阳性表达率为 54.7%（35/64） ，cyclin D1 阳性率为 42.2%（27/64） ，PCNA LI (Labelling index)为 2.2%-80.5%，10 例正常脑组织中 NFB p65, cyclin D1 均无 1 例阳性表达，PCNA 低表达或无表达. NFB p65, cyclin D1 及 PCNA 的表达与星形细胞肿瘤的恶性程度有关. NFB p65表达与 cyclin D1, PCNA 的表达呈显著正相关. 结论： NFB p65 是与星形细胞肿瘤相关的癌蛋白，NFB
7、 p65 上调 cyclin D1, PCNA 的表达，致使肿瘤细胞过度增殖，从而导致肿瘤的发生. 【关键词】 核因子 B；细胞周期素 D1；细胞增殖核抗原；星形细胞肿瘤；免疫组织化学 0 引言 细胞周期失控是许多肿瘤发生发展的重要原因. 细胞周期素 D1 (cyclin D1) 是细胞周期正性调节子，在细胞周期1 期发挥着重要作用. 增殖性细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 是细胞 DNA 合成必不可少的一种因子，能反映细胞增殖活动. 核因子B（nuclear factor of kappa B，NFB）是一种多向调节功能的转录因子
8、，广泛参与许多基因的转录调控，有研究表明其在细胞增殖及凋亡中具有核心的调节作用1. 我们应用免疫组化技术检测星形细胞肿瘤和正常脑组织石蜡切片中 NFB p65 亚单位蛋白、cyclin D1 和 PCNA 蛋白的表达，并探讨它们之间及其与星形细胞肿瘤病理分级间的关系. 1 材料和方法 1.1 材料收集我院及武汉大学人民医院 199502/199812 经手术切除且随访资料完善的星形细胞肿瘤 64（男 35，女 29）例. 均经病理学证实. 年龄 778(平均 43.4)岁. 按 1993 年 WHO 中枢系统肿瘤分类法分为级8 例，级 18 例，级 22 例，级 16 例，所有病例术前均未行放
9、化疗. 以脑外伤颅内减压手术中获得的 10 例正常脑组织作为对照研究. 1.2 方法全部新鲜标本 24 h 内经 40 g L-1 甲醛固定，常规石蜡包埋. 4 m 厚度的连续切片 4 张， 1 张 HE 染色复查诊断，3 张行免疫组化研究. 兔抗人 NFB p65 mAb, cyclin D1 和 PCNA mAb 购自北京中山生物技术公司,SP 免疫组化染色试剂盒购自福州迈新公司. 染色方法按链霉素抗生物素蛋白过氧化物(SP 法)试剂盒说明书步骤进行，以PBS 代替一抗作为阴性对照. 用已知阳性切片作阳性对照 . NFB p65 亚单位以细胞质、细胞核均出现棕黄色颗粒为阳性细胞，在高倍视野
10、下记数 1000 个细胞. 阳性细胞数占全部肿瘤细胞数比例5%为阳性表达，5%为阴性表达. cyclin D1 以胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，在高倍视野下记数 1000 个细胞. 阳性细胞数占全部肿瘤细胞数比例10%为阳性表达，10%为阴性表达. PCNA 以胞核出现棕黄色颗粒或棕褐色为阳性细胞. 对每例切片，均随机观察 5 个高倍视野(400),记数阳性细胞总数，用标记指数（Labelling Index, LI）表示,即 LI(阳性细胞数/计数细胞数)100，并取平均值定义为肿瘤的 PCNA LI. 统计学处理：采用 SPSS10.0 统计软件进行 t 检验，方差分析，2检验及 Spea
11、rman 等级相关分析. 2 结果 2.1NFB p65 蛋白的表达在星形细胞瘤组织中 NFB p65 免疫组化阳性染色为细胞质和细胞核均出现棕黄色颗粒（Fig 1A） ，64 例星形细胞瘤中 NFB p65 阳性率 54.7%. 低度恶性星形细胞瘤()NFB p65阳性率 34.6%，高度恶性星形细胞瘤()NFB p65 阳性率 68.4%，两者有显著性差异（2=7.12, P0.01） ；NFB p65 阳性率级瘤随着星形细胞肿瘤级别的增加而增加（2=12.23, P0.01）. 正常脑组织中未见 NFB p65 阳性染色(Tab 1). 2.2cyclin D1 蛋白的表达 cyclin
12、 D1 免疫组化阳性细胞为胞核着色（Fig 1B） ，64 例星形细胞肿瘤中 cyclin D1 的阳性表达率42.2%（27/64） ，正常脑组织未见 cyclin D1 阳性染色. 在高、低度恶性星形细胞肿瘤组织中 cyclin D1 的表达差异显著（2=9.46, P0.01）. 级星形细胞肿瘤相邻级别之间 cyclin D1 阳性率有显著性差异(2=10.55, P0.05, Tab 1）. 2.3PCNA 蛋白的表达 PCNA 免疫组化阳性细胞为胞核着色（Fig 1C） ，64 例星形细胞肿瘤中均有不同程度 PCNA 的阳性表达，PCNA LI 2.2%-80.5%，正常脑组织未见
13、PCNA 阳性染色. 在高、低度恶性星形细胞肿瘤组织中 PCNA 的表达差异有显著性意义（t=12.85, P0.05）. 级星形细胞肿瘤相邻级别 PCNA 阳性率之间差异有显著性意义(F=2.162, P0.05, Tab 1）. 2.4NFB p65 表达与 cyclin D1, PCNA 表达的关系在 35 例 NFB p65 蛋白阳性者中，cyclin D1 蛋白表达阳性例数为 23 例，29 例 NFB p65 蛋白阴性者中，cyclin D1 蛋白阳性例数 2 例，cyclin D1 的表达与NFB p65 异常表达密切相关 (2=27.08, P0.01） ， 且两者之间存在着正
14、相关关系（r=0.650, P0.01）. PCNA LI 与 NFB p65 表达也存在着正相关关系（r=0.544, P0.01）. 表 1NFB p65,cyclin D1 和 PCNA 在脑星形细胞肿瘤中表达（略） Tab 1Expression of NFB p65, cyclin D1 and PCNA in astrocytic tumors（略） 图 1 星形细胞瘤级免疫组化染色（略） Fig 1Glioblastoma mutiforme（略） 3 讨论 核因子 B 是 1986 年 Sen 和 Baltimore 首先从 B 淋巴细胞核抽提物中检出的，在大多数细胞中，最常见
15、的二聚体是 p50/ RelA 异源二聚体. 这些二聚体通过与抑制蛋白 IB 直接结合形成无活性的三聚体存留于胞质，活化后二聚体进入细胞核，作用于靶基因，诱导相关基因的表达. 目前发现在很多肿瘤如白血病、淋巴瘤、大肠癌、前列腺癌及星形细胞肿瘤等肿瘤中均存在着 NFB 的异常活化2-4 ，但其与人脑肿瘤组织病理之间的关系尚不明确. 本研究表明,星形细胞肿瘤中 NFB p65 阳性率为 54.7%，而正常脑组织中 NFB p65 免疫组化结果均为阴性，说明NFB p65 蛋白异常表达与胶质恶性程度密切相关，表明 NFB 在星形细胞肿瘤的发生中发挥重要调节作用，是一个与星形细胞肿瘤相关的癌基因蛋白.
16、 肿瘤是一种细胞周期病，细胞周期不同时相间存在关键的调控点，由于细胞表现为增殖失控，对 G1 期 S 期间的调控点的研究就更为重要5. cyclin D1 基因表达的异常在许多肿瘤细胞中存在, cyclin D1的过量可使细胞失去对生长因子的依赖，导致肿瘤的发生；在乳腺癌、食管癌、喉癌、肺癌、以及肝癌等多种肿瘤中均发现 cyclin D1 的基因扩增及过表达，且 cyclin D1 的过表达与肿瘤的复发、淋巴结转移以及预后不良相关6, 7 ，我们发现在星形细胞肿瘤中 cyclin D1 蛋白表达率为 42.2，其与肿瘤的病理分级密切相关，并随着肿瘤恶性程度的增加，阳性率也增加，证实了 cycl
17、in D1 也是星形细胞肿瘤的癌基因之一. PCNA 是一种非组蛋白核蛋白，是 DNA 合成所必需的 DNA 多聚酶的辅助蛋白，可使多聚酶酶活性增加几百倍，有报道表明 PCNA 与肺癌的生长和恶性行为有关8 ，与少枝胶质星形细胞瘤和室管膜瘤的预后密切相关9, 10 ，PCNA LI 与胶质瘤的病理分级存在着正相关关系11, 12 ，我们发现在星形细胞肿瘤中 PCNA LI 为 2.2%-80.5%，其与肿瘤的病理分级密切相关并随着肿瘤恶性程度的增加，PCNA 标记指数也增加，说明 PCNA LI可以反映星形细胞肿瘤的增殖行为和恶性程度，对肿瘤的预后判断有一定的意义. NFB 活化通过作用于 c
18、yclin D1/CDK/CKI 系统进行细胞增殖的调控. 凝胶迁移率试验分析(EMSA)证实 NFB 在 cyclin D1 启动子上有3 个结合位点. NFB 活化后通过促进 cyclin D1 表达、pRB 高磷酸化及G1/S 期转换而加速细胞周期行进，并抑制细胞分化. 最近研究表明在恶性胶质母细胞瘤出现 NFB 构成性活化并通过 cyclin D1 作用于肿瘤的细胞周期，但是恶性转化具体机制尚不清楚13. 本试验结果证实星形细胞肿瘤中 NFB 与 cyclin D1 具有明显的正相关性（r=0.650, P0.01） ，与 PCNA LI 具有明显的正相关性（r=0.544, P0.0
19、1） ，证实 NFB 的活化作用于 cyclin D1 及 PCNA 导致细胞周期调节失控，细胞表现为自主分裂和无限增殖，这在肿瘤发生中具有重要意义，进一步提示在脑星形细胞瘤中联合检测这两种指标有助于判断肿瘤的预后，并指导临床治疗. NFB, cyclin D1 都可能成为肿瘤治疗中新的靶基因 . 肿瘤治疗中的细胞因子、放疗和化疗药物都因 NFB 的激活而降低他们的治疗效果14 ，因而不同水平、不同层次的抑制 NFB, cyclin D1 和 PCNA 在一定程度上可抑制细胞由 G1 向 S 期过渡，改变转化细胞形态，为星形细胞肿瘤治疗提供新的思路. 【参考文献】 1 Bharti AC, A
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