1、悬浮芯片法与常规酶联免疫吸附法检测 3种兽药残留的比较作者：刘楠 苏璞 高志贤 朱茂祥 杨陟华 潘秀颉 晁福寰 【摘要】 建立氯霉素，克伦特罗和雌二醇 3 种兽药残留同时检测的悬浮芯片法。通过将 3 种兽药的 BSA 蛋白结合物偶联于悬浮芯片的固相载体聚苯乙烯荧光微球上作为检测探针，采用间接竞争法，在液相反应体系中，3 种小分子兽药抗原和微球上的兽药结合物共同竞争液相中各自特异性的生物素化单抗，再加入藻红蛋白标记的链霉亲和素，反应后检测获得荧光信号，绘制出 3 种兽药残留检测的标准曲线。同时进行3 种兽药的常规酶联免疫吸附法标准曲线的测定。在检测技术、检出限、检测区间、特异性、盲样测定和多元分
2、析等方面对两种方法进行比较。除了特异性外的其它指标的比较中，悬浮芯片法均具有明显优势。两种方法的特异性检测具有良好的一致性。高通量悬浮芯片技术，具有操作简单、灵敏快速和成本低廉等优点，为多种兽药残留的快速检测提供了新方法。 【关键词】 悬浮芯片， 酶联免疫吸附法， 残留， 微球， 中位荧光强度值Abstract A novel suspension array technology was established for the detection of three kinds of veterinary drug residues: chloramphenicol, clenbuterol
3、and 17estradiol. The three conjugates in which veterinary drugs coupled with BSA were immobilized on the solid carrier of the suspension microarraypolystyrene fluorescent microspheres/beads as detective probes. Indirect competitive technology was employed. Competitive reactions between the veterinar
4、y drugs in the aqueous phase and the veterinary drugsBSA conjugates on the beads for coupling with their complimentary specific biotinylated monoclonal antibodies were carried out. And then, straptavidinphycoerythrin was added for coupling and the fluorescent signals were captured. Afterwards the de
5、tective standard curves were plotted. The regular ELISA standard curves of the three veterinary drugs were also plotted. Comparison between suspension array and regular enzymelinked immunosorbent assay(ELISA) was in the respects of the detective technology, the detection limits, the detective ranges
6、, the samples detection and the multianalysis. Suspension array technology is distinct advantageous except for specificity. There was well consistent performance between the two methods. The highthroughput suspension array provides a novel method for multianalysis of veterinary drugs with simple ope
7、ration, sensitive, rapid and low costing.Keywords Suspension microarray, Enzymelinked immunosorbent assay, residue, microspheres beads, median fluorescent intensity1 引 言近年来，食品安全已成为社会共同关注的公共卫生问题，而兽药残留成为食品安全监管的重要问题。兽药残留如克伦特罗 (clenbuterol, CL)、氯霉素(chloramphenicol, CAP)和雌二醇 (17estradiol, E2)的滥用和食用可导致多种健
8、康损害16。加强兽药残留检测分析是监管和控制兽药残留的重要手段。因此，简单、快速和灵敏的微痕量检测技术的研究和创新尤为重要。目前，酶联免疫吸附测定法(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)7,8是兽药残留的主要检测方法之一具有简单、快速、灵敏度高和特异性强等诸多优点9。悬浮芯片技术是一种多功能的液相芯片分析平台，既具有固态片膜芯片的高通量特性，又具有操作简便、重复性好、灵敏度高等优点。目前，对该技术的研究多集中于大分子蛋白质和核酸的检测1012，并未见应用悬浮芯片同时检测多种兽药 CAP、CL 和 E2 的报道。本研究采用悬浮芯片法和常规 ELISA
9、法对 3 种兽药进行同时检测，并在灵敏度、特异性、检出限等方面进行比较。2 实验部分2.1 仪器和试剂BioPlex 悬浮系统，Model 680 型酶标仪(美国 BioRad 公司)；MALDITOFMS REFLEX型质谱仪(德国 Bruker 公司)，DU530 型紫外 可见分光光度计 (美国 Beckman 公司);6930 型冷冻离心机(日本Kubota 公司)；MS3 型旋涡混匀器(德国 IKA 公司)，YM10 过滤柱 (孔径1.2 m，美国 Millipore 公司)，Costar96 孔酶标板 (美国 Corning公司)； 日立 S4500 型扫描电镜 (日本 Hitach
10、i 公司)。3 种不同编码的荧光微球(beads，=5.6 m)和蛋白氨基偶联试剂盒（包括激活缓冲液和储备缓冲液）购自美国 BioRad 公司;CAP 单克隆抗体和 E2 单克隆抗体(美国 Biodesign 公司)；CL 单克隆抗体 (英国Abcam 公司)；3 种单抗的生物素化由本实验室完成；CAP、CL、E2、EDC、SulfoNHS 、沙丁胺醇、莱克多巴胺、N,N 二甲基甲酰胺 (DMF)、邻苯二胺(OPD)和 E2BSA 结合物(美国 Sigma 公司)；链霉亲和素 藻红蛋白(Straptavidinphycoerythrin, SAPE ，美国Invitrogen 公司)；BSA(
11、德国 Roche 公司)； CAPBSA 和 CLBSA 为本实验室合成。其它试剂均为国产分析纯。2.2 实验方法2.2.1 悬浮芯片检测微球的制备 参照试剂盒说明书，取 3 种荧光微球 (1.25107 个/mL)，磷酸盐缓冲液 (PBS) 重悬后，加入到激活缓冲液中，并立即加入新鲜配制的偶联试剂 EDC 和 SulfoNHS( 浓度均为 50 g/L)，室温下搅拌 20 min 使其活化；活化后，分别加入 3 种兽药的 BSA 结合物 5 g，并用 PBS 缓冲液（pH 7.4）定容至 500 L，室温下中速旋涡振荡混匀 2 h，14000 g离心 4 min，弃去上清液，封闭，清洗，加入
12、储备缓冲液， 4 储存。上机进行偶联确证，以便用于下一步测试。2.2.2 3 种兽药的悬浮芯片多元分析标准曲线的测定 实验采用间接竞争法，在 96 孔反应板的每个反应孔中分别加入优化后的 3 种靶标物对应的生物素化单抗 5、1 和 16 ng，分别将 CAP、CL和 E2 的标准品(以下涉及到 3 种兽药均按此顺序)按照 5、5和 3梯度分别稀释成 7 个梯度加入。将 3 种荧光微球等比例混合，每孔加入 3种荧光微球各 2000 个，并用 PBS 补足至 50 L/孔，同时再各准备一个不加标准品的阳性对照孔。37 中速漩涡振荡 2 h，使荧光微球上的兽药 BSA 结合物与溶液中相应的标准品共同
13、竞争生物素化的单抗，然后加入 1100 的 SAPE 50 mL/孔，37 中速振荡反应 30 min。悬浮芯片读取每孔 100 个荧光微球，获得中位荧光强度值(MFI)。以各种靶标标准品的浓度为 X 轴，以检测得到的 MFIs 为 Y 轴，绘制 3 种兽药小分子的悬浮芯片检测标准曲线。2.2.3 3 种兽药的常规 ELISA 标准曲线的测定 采用间接竞争法1315，在酶标板上包被小分子兽药的 BSA 结合物，以方阵滴定法筛选和优化 3 种兽药常规 ELISA 的包被原量(分别是2、0.2 和 0.25 g)和单抗工作浓度 (稀释度分别为180000、120000 和 180000)，确定反应
14、条件后，选择 3 种兽药标准品的浓度，绘制各自的标准曲线。2.2.4 两种方法对 3 种兽药残留的特异性测试 准备 3 组沙丁胺醇、莱克多巴胺、庆大霉素和红霉素测试品，终浓度达到 50、 1250 和 31250 ng/L，每个浓度平行做 3 个样，同时准备一个阳性对照样，悬浮芯片读数并与阳性对照样比较。以交叉反应率(CR%)测试常规 ELISA 检测的特异性。2.2.5 3 种兽药盲样的检测比较 准备 3 个浓度的 3 种兽药盲样，交由测试者进行检测，每个盲样平行测试 3 次。根据得到的标准曲线计算盲样的浓度，并与实际浓度进行比对。3 结果与讨论3.1 悬浮芯片法对 3 种兽药检测标准曲线的
15、测定按优化的比例加入相应的抗体和 SAPE ，使反应充分进行，可省去真正的悬浮芯片反应所需的抽滤步骤。因此，检测更加简单快速。在优化条件下，绘制标准曲线方程（见图 1 和表 1） 。由于每次检测取 100 个荧光微球，每个荧光微球都有 1 个独立的检测值，也即每个样品 (包括标准品)被重复测试了 100 次，样本量有足够的代表性。由于 E2 难溶于水，加入少量 DMF 可增加其溶解度，实验发现，抗体活性并未受影响。CAP、CL 和 E2 悬浮芯片的检测区间分别为506.25105 ng/L, 567.81105 ng/L 和 11037.29105 ng/L; 它们的检出限分别为 50、56
16、和 1000 ng/L，检测范围跨 24 个数量级。在这些范围内，可对这 3 种兽药同时进行快速的定量测定，全部检测过程只需约 2.5 h。检测标准曲线的这些指标和荧光微球上的抗原结合物的偶联量、抗体的亲和力、单抗的生物素化程度都有密切关系。3.2 ELISA 法对 3 种兽药检测标准曲线的测定按照棋盘滴定所获得的最佳抗原结合物包被量和最适抗体稀释度，对 CAP、CL 和 E2 残留进行标准曲线的测定和绘制，结果如图 2 所示。标准曲线方程、检出限和检测区间等各参数见表 1。比较悬浮芯片法和常规ELISA 法可见：在 CAP 的检测中，常规 ELISA 法的检测区间略比悬浮芯片法稍宽，但不存在
17、绝对的优势；而在 CL 和 E2 的检测中，悬浮芯片法的检出限明显低于常规 ELISA 法，检测区间比 ELISA 法宽，这在实际检测中占有较大优势。悬浮芯片法主要应用于多元靶标物的分析检测，而常规 ELISA 每次只能检测一个目标物，在多元分析中处于劣势。表 1 悬浮芯片法和 ELISA 法检测 3 种兽药残留的比较（略）3.3 悬浮芯片法和常规 ELISA 法在检测技术上的比较悬浮芯片法使用的检测原理同常规 ELISA 法一样，同为间接竞争法，所用试剂略有不同。但在检测的灵敏度和检测区间上悬浮芯片法明显优于常规 ELISA 法。两种方法存在性能差异的主要原因如下：(1)悬浮芯片抗原以化学键
18、进行偶联，而 ELISA 法利用一种物理性的非特异性吸附，其连接的牢固程度和稳定性比悬浮芯片的抗原偶联方式差很多。(2)悬浮芯片激光检测器的分辨率明显高于 ELISA 法采用的普通酶标仪，检测更加灵敏。(3)悬浮芯片技术使用主要试剂是生物素 亲和素，其亲和力高达 1015L/mol16,17，比抗体亲和力高 10000 倍以上。悬浮芯片技术信号放大更灵敏，更稳定，受环境干扰较小。(4)悬浮芯片的抗原抗体反应在液相中进行，有效地保证了试剂的活性；而且检测微球的比表面积远大于酶标板的底部，使反应更加充分；而 ELISA 法反应在固相中进行。(5)悬浮芯片的标准曲线是多元参数的 Logistic 回
19、归曲线，检测范围宽；而常规 ELISA 法多用直线方程，使用曲线方程在一定程度上可增加其检测范围。3.4 两种方法检测的特异性测定由表 2 可知，不同浓度下的沙丁胺醇莱克多巴胺的 MFI 和阴性对照组无显著性差异，P0.05；加入不同浓度庆大霉素和红霉素对检测无明显干扰，P0.05。因此，悬浮芯片检测的特异性良好，与其它药物无明显交叉反应。同时，用 ELISA 对表 2 中药物的 CR 进行测定，CR 均5%。两种方法的特异性均良好，这与反应所用单抗的特异性有直接关系。表 2 悬浮芯片检测不同浓度多种化学物质加入所获得的 MFI（略）3. 5 盲样的测定测试结果和实际浓度值的比对见表 3。由表
20、 3 可见，悬浮芯片检测浓度值与实际浓度偏差为 8.09%17.03%，可认为偏差相对较小。由于多种靶标物盲样的浓度低于 ELISA 的检出限，并未能对其进行检测。在其检测区间内，ELISA 与实际浓度偏差为 9.19%17.74%，偏差也相对较小。悬浮芯片法对盲样测定的检测区间较宽，与 ELISA 法相比，有较大的优势。表 3 3 种兽药残留盲样的检测（略）【参考文献】1 Pellegrino M A, DAntona G, Bortolotto S, Boschi F, Pastoris O, Bottinelli R, Polla B, Reggiani C. Exp. Physiol.
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