1、血小板因子 4 对环磷酰胺诱导化学损伤小鼠骨髓细胞的保护作用作者：宋俊玲 杨岚 田琼 袁诚君 【关键词】 血小板因子 关键词: 血小板因子;环磷酰胺;造血干细胞 摘 要:目的 探讨血小板因子 4（PF4）对环磷酰胺（CTX）诱导化学损伤小鼠骨髓的保护作用及机制. 方法 环磷酰胺 200mgkg-1 ，腹腔一次性注射，造成药物损伤模型.给 CTX 前给予 PF4 预处理，给药后动态观察小鼠外周血白细胞数的变化，并于第 5 和第 8 日，分别用流式细胞仪（FCM）测定骨髓有核细胞 DNA 的含量及细胞周期变化. 结果 注射 CTX 后 4d，外周血白细胞降至最低点，然后逐渐回升，但 PF4 处理组
2、与单独 CTX 处理组比较无差异（P0.05）.第 5 日 PF4 处理组的骨髓有核细胞中，G0 /G1 期细胞的百分率较 CTX 组明显提高，细胞的坏死、凋亡率下降（P0.01） ，而与 PBS 对照组基本相同（P0.05）.第8 日 PF4 处理组的骨髓有核细胞数较单独 CTX 处理组增加明显（P0.01）. 结论 PF4 对 CTX 损伤的小鼠骨髓细胞有保护作用，可作为肿瘤患者使用烷化剂化疗时的骨髓防护剂. Keywords:platelet factor;cyclophosphamide;hematopoietic stem cell Abstract:AIM To provide e
3、vidence for studying the chemo-protective effect of PF4and its machanism on murine hematopoietic cells treated with CTX.METHODS The mice were intraperitoneal（IP）injected with PF4（40gkg-1 ）twice at6h intervals.20h after the second injection they were given one injection of CTX（200mgkg-1 ）to make the
4、models of chemical lesions.Then the numbers of their peripheral WBC were observed.5d，8d later the DNA contents in bone marrow cells were detected by flow cyteme-try（FCM）.RESULTS There were no difference between the peripheral WBC counts of PF4treatment groups and the one of CTX groups（P0.05）.On day5
5、，bone marrow cells in G0 /G1 phase in PF4treatment groups were significantly higher than that in CTX groups，and the necrotic and apop-totic percentage were significantly lower，but there was no difference between the PF4groups and the PBS control groups.On day8after CTX treatment，bone marrow cellu-la
6、rity in PF4treatment groups were significantly higher than that in CTX groups.CONCLUSION PF4can protect murine bone marrow from the cytotoxic effects of CTX.PF4should be a potent protective agent during chemotherapy. 0 引言 骨髓造血系统是对化疗非常敏感的组织，在造血系统恶性肿瘤的治疗过程中，常因骨髓造血抑制而限制化疗药物的剂量，直接影响肿瘤的治疗效果.环磷酰胺（CTX）是肿瘤化
7、疗中最常用的烷化剂，但其对正常骨髓细胞也有很强的抑制作用.此外，作为免疫抑制剂的化疗药物，CTX还是干细胞移植前预处理最常用的药物之一.已有研究表明，血小板因子4（PF4）对 5-FU 处理的小鼠骨髓有明显的保护作用1 .但 Han 等2 体外实验证明，PF4 对 HL-60，HEL，SMMC7721 及 MKN-45 等肿瘤细胞株无保护作用.PF4 的保护作用与其能可逆性抑制造血干/祖细胞的增殖有关3 ，但对烷化剂 CTX 的作用至今尚未见报道.为进一步探讨 PF4对 CTX 诱导的损伤小鼠骨髓造血干细胞的影响，我们建立了 CTX 诱导小鼠骨髓损伤的实验动物模型.通过流式细胞仪测定细胞周期的
8、变化，探讨了 PF4 对造血干细胞的化疗保护作用的机制. 1 材料和方法 1.1 材料 动物:一级 BALB/c 小鼠 36 只，雄性，体质量 1820g，鼠龄 1012wk，由第四军医大学实验动物中心提供;药物:PF4 购自 Sigma公司，系 500g 甘氨酸缓冲液冻干品，用 5mL 三蒸水稀释成工作液，4冰箱备用，稀释浓度为 100mgL-1 .CTX 由江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号 01111221，200mg/支，溶于 10mL 生理盐水中，稀释浓度为 20gL-1 . 1.2 方法 1.2.1 分组 将 36 只小鼠随机分为 3 组，即 PF4 处理组、单独 CTX处理组和
9、PBS 对照组，每组 12 只.PF4 处理组:小鼠一次性 ip CTX，剂量为 200mgkg-1 ，用 CTX 前 26h 和 20h 各 ip PF4，剂量为40gkg-1 .单独 CTX 处理组:CTX 用法同上，给 CTX 前 ip 等体积的 PBS 缓冲液.PBS 对照组:按上述方法注射等体积的 PBS.各组分别于给 CTX 前及给 CTX 后 2，4，5，6 和 8d 取尾静脉血进行白细胞计数. 1.2.2 制备骨髓有核细胞悬液 给予 CTX 后第 5 日及第 8 日每组小鼠各取 6 只，以颈椎脱臼法处死.取出股骨，剔除肌肉和结缔组织，剪开股骨两头，用 6 号针头以 RPMI16
10、40 液冲出骨髓细胞，再用 4 号针头过滤制成单个骨髓细胞悬液，检测骨髓有核细胞（bone marrow karyocyte，BMK）数. 1.2.3 样品制备 将上述单个骨髓细胞悬液离心（1000rmin-1 ，5min） ，弃上清，用 PBS 洗涤 2 次，再加入 1mL PBS 重悬成单细胞悬液，加入 2mL 无水乙醇，立即混匀，用封口膜封口，放置 4冰箱冷藏备用.每份样品的细胞数约为（510）105 个. 1.2.4 细胞周期分析 取上述样品，用 PBS 洗 2 次，以洗去残留的无水乙醇，加 100L PBS 后混匀，用碘化丙锭染色后，以流式细胞仪分析细胞周期及 DNA 含量的变化.以
11、上实验均重复 2 次. 统计学处理:数据用 x s 表示，组间比较采用 t 检验. 2 结果 2.1 PF4 对 CTX 损伤小鼠外周血白细胞的影响 各组小鼠外周血白细胞的动态变化见 Fig1.单独用 CTX 后 4d，WBC 降至最低点，下降约86.0%，从第 5 日起开始回升，但与 PF4 处理组相比较无显著差异 （P0.05） ，表明 PF4 对 CTX 化学损伤小鼠白细胞数的下降无明显促进其恢复的作用. 图 1 PF4 对 CTX 损伤小鼠白细胞的影响 略 2.2 PF4 对 CTX 损伤小鼠骨髓细胞数的影响 单独用 CTX 后 5d，骨髓细胞数减少约 28.0%，8d 后有明显上升.
12、PF4 处理组与单独 CTX 处理组相比较，注射 CTX 后 5d 骨髓细胞数无明显增加，但第 8 日增加较明显（P0.01，Tab1）. 表 1 PF4 对 CTX 损伤小鼠骨髓细胞数的影响 略 2.3 PF4 对 CTX 损伤小鼠骨髓细胞周期的影响 流式细胞仪 DNA 直方图显示:第 5 日 PF4 处理组（Fig2A）经 PF4 预处理后仅有 0.5%发生坏死、凋亡，而单独 CTX 处理组（Fig2B）细胞的 G0 /G1 峰前出现荧光强度较低的坏死、凋亡峰，约占 12.6%，CTX 组与 PBS 对照组（Fig2C）及 PF4处理组相比差异均有显著性（P0.01）.细胞周期分布分析显示
13、，PBS对照组正常骨髓细胞多数处于 G0 /G1 期，S 期次之，G2 /M 期最少，CTX组的细胞周期发生变化，G0 /G1 期细胞占 75.7%，而 PF4 处理组 G0 /G1 期比例占 82.1%，较单独 CTX 处理组明显增多，差异有显著性（P0.01）.第 8 日（Fig2D 为 CTX 组）3 个组比较 G0 /G1 期比例无明显差异（P0.05）. 3 讨论 PF4 是激活的血小板 颗粒释放的特异蛋白，属于 CXC 类趋化因子，除与炎症有关外4，5 ，与多种细胞的生物功能均有着密切联系，其中与造血和肿瘤的关系日益受到重视，包括抑制血管新生6，7 、抑制内皮细胞增殖8 及以依赖和
14、不依赖肝素两种途径抑制造血干/祖细胞的增殖9-11 .因此，PF4 又属于造血负调控因子12，13 .已有研究表明，PF4 对早期造血干/祖细胞尤其早期巨核细胞的增殖、分化有抑制作用，其抑制巨核细胞集落形成的作用是可逆的，停用 PF4 后巨核细胞即恢复增殖活性，从而对造血干细胞起到了保护作用1，3，14 .环磷酰胺是肿瘤化疗最常用的烷化剂，通过与 DNA 交叉联结，而直接破坏DNA，其疗效高低与血药浓度成正比.除对 G0 期（静止期）细胞作用较弱外，对增殖周期中各期细胞均有破坏作用，还可致染色体畸变、突变而影响分裂，引起造血细胞的坏死、凋亡15，16 .本实验显示，200mgkg-1 环磷酰胺
15、可引起骨髓细胞坏死、凋亡，第 5 日比例达 12.6%，与正常对照组相比，差异有显著性;经 PF4 预处理后其坏死、凋亡率明显下降，而 G0 /G1 期细胞相对增多，与环磷酰胺组相比差异有显著性，表明 PF4 可降低造血干细胞对化疗药物的敏感性，避免环磷酰胺诱导的凋亡、坏死，从而保护造血干细胞.但第 8 日 PF4 处理组与对照组比较 G0 /G 1 期比例无明显差异（P0.05） ，进一步证实了 PF4 对造血干细胞的抑制作用是短暂、可逆的. 图 2 PF4 影响 CTX 损伤小鼠 BMK 细胞周期分布的 FCM 分析 略 关于 PF4 这种保护作用的机制还不十分明确.本实验证实，PF4 可
16、阻止 G0 /G1 期细胞进入 S 期，从而使 G0 期（静止期）细胞增多，可避免受细胞毒药物的损害.用 PF4 预处理后其骨髓细胞总数增加，尤其是可提高骨髓造血干/祖细胞静止期的数量，这样根据一定的化疗药物杀伤恒定数目的骨髓造血干/祖细胞15 ，故化疗后活存的造血干/祖细胞绝对值增多，有利于造血功能的重建.Han 等2 研究显示，转化生长因子1（TGF1） 、足叶乙甙单用或与 PF4 联用相比，与 PF4 联用组凋亡细胞明显减少，表明 PF4 可避免细胞毒药物和转化生长因子（TGF1）诱导的凋亡，与本实验相符.结合文献，其干扰细胞周期的分子机制可能是通过阻止 P21Cip1/WAF1 下调，
17、进而抑制 CyclinE-cdk2 的活动，并使视网膜胚细胞瘤蛋白（PRb）磷酸化减弱，引起 G0 /G1 期阻滞8 .有趣的是，PF4 仅对正常造血干细胞起这种作用，因而可以避免化疗的细胞毒作用而诱发正常细胞的凋亡，而对白血病细胞和非造血系统瘤细胞则无以上作用2 ，提示 PF4 在肿瘤治疗方面的巨大临床应用潜力. 目前化疗和放疗仍是治疗肿瘤的主要手段，在杀伤肿瘤细胞的同时对代谢旺盛的正常造血细胞也有杀伤作用，甚至造成早期造血干细胞不可逆的损伤，致使患者因严重感染和出血而死亡.临床上广泛应用的GM-CSF，G-CSF 等集落刺激因子，虽然能刺激造血细胞的增殖及分化，并加快中性粒细胞从骨髓释放入
18、血，及促进中性粒细胞的存活和功能完善，但对造血干细胞无保护作用，因而仍不能挽救严重骨髓抑制者的生命12 .而 PF4 因其可逆性抑制作用而使相对未成熟的早期造血干/祖细胞增多，这些细胞因处于分化过程的较早阶段而对环磷酰胺的毒性相对不敏感，从而可避免环磷酰胺诱发的凋亡、坏死，起到保护造血干细胞的作用，显示 PF4 作为骨髓保护剂的应用潜力.因而本实验为 PF4 用于预防肿瘤患者的烷化剂化疗所致骨髓功能抑制提供了实验依据，其机制有待于进一步深入研究.本实验还发现，PF4 不仅可以减少造血干/祖细胞的损伤，而且还能促进造血干/祖细胞的恢复，这与本实验室早先的研究结果符合17 . 参考文献: 1Aid
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