1、烟草浸提液对大鼠体外培养成骨细胞的影响作者：王桂龙 侯玉东 石玲波 【摘要】 目的 探索烟草浸提液对体外培养成骨细胞的附着和生长的影响。方法 将周龄 SD 大鼠颅盖骨，剪成 1.5 mm1.5 mm 大小组织块，先用 0.25胰蛋白酶消化 20 min、0.1型胶原酶消化 30 min 后，再对其进行培养。倒置显微镜观察细胞形态，并对其碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化能力进行鉴定。实验分对照组和实验组，实验组按所加烟草浸提液浓度的不同分为 0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25 和 50 gL 7 个浓度组，分别测定各实验组细胞的生长曲线。采用 SPSS13.0 软件包对数据进行双因素方
2、差分析。结果 烟草浸体液对成骨细胞的附着和生长起抑制作用，并随其浓度的升高而增强。各处理组间存在显著差异（P0.01） ；各组内的前 3 d 存在显著性差异（P0.01） ，但 3.250 gL 组第47 天间比较差异无统计学意义（P0.05） 。结论 吸烟不利于口腔种植的临床愈合。 【关键词】 成骨细胞；原代培养；SD 大鼠；烟草浸提液 【Abstract】 Objective To investigate the effects of smokeless tobacco extract(ST) on the attachment and growth of the rats osteobl
3、asts in vitro.Methods The bone tissues from the calvaria in rats aged 1 week were cut into blocks of 1.5 mm 1.5 mm.They were digested by 0.25 trypsinase for 20 minutes and by 0.1 collagenase II for 30 minutes and then the liquid supernatant was abandoned. The bone blocks were cultured to acquire iso
4、lated cells.The identification was conducted by cell morphology,histochemical staining of alkaline phosphatase (ALPase)and calcified nodules staining.The experiments were divided into control group and experiment groups.The experiment groups were divided into seven groups by the smokeless tobacco ex
5、tracts concentration: 0.8,1.6,3.2,6.4,12.5,25 and 50 gL, then the cell growth curves were drawn. Statistical analysis was performed using SPSS13.0 software package for twoway ANOVA.Results ST inhibited attachment and growth of osteoblasts in all groups with a concentrationdependent manner. The diffe
6、rence among all of groups was significant（P0.01）; the difference between the same group was significant before 3 days（P0.01）, while the difference among 3.250 gL groups was no significant after 4 days（P0.05）.Conclusion Smoking is harmful to the clinic healing of oral implant operation. 【Key words】 o
7、steoblast,primary culture,rats,smokeless tobacco extract 目前，口腔种植技术因其独特的优势而获得了临床医师及患者的青睐，而骨结合则是其成功的基础。骨组织作为一种特殊的钙化组织，主要由成骨细胞完成并受体内多种因素调控。随着细胞培养技术的发展，成骨细胞的体外培养成为可能。体外培养的成骨细胞可以排除体内多种因素的相互影响，从而为骨形成和代谢机理方面的研究提供有价值的实验依据。目前成骨细胞原代培养的方法主要有 2 种：酶消化法和组织块法1,2 。酶消化法虽可获得大量细胞，但获得的细胞不纯。本实验拟采用酶消化后再对组织块进行培养的方法来获得纯度较高
8、的成骨细胞，观察烟草浸提液对成骨细胞的附着及生长的影响，以期证明吸烟是影响口腔种植的不利因素之一。 1 材料和方法 1.1 器材和试剂 1.1.1 主要仪器设备和材料:超净工作台 (苏州集团安泰公司)；CO2 培养箱 (Heraeus)；荧光倒置显微镜 (日本 OLYMLOS)；眼科手术器械（上海手术器械厂） ；血球计数板（镇江市丹徒科达医疗用品厂） ；50 ml 玻璃培养瓶（Costar） ；离心机（雷动尔 LDZ52 ） ；高糖DMEM（ibco） ；胰蛋白酶（Amresco） ；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所） ；胶原酶（Invitrogen） ；烟草（成品盒装香烟，烟气烟碱量
9、1.2 mg，焦油量 13 mg） ；SD 大鼠（烟台绿叶实验动物中心） 。 1.1.2 主要试剂的配制:含烟草浸提液培养液的配制3:称取 5 g 成品盒装香烟的烟丝，加入 0.1 L 的双蒸水，在 37 孵育箱中浸泡 48 h，过滤除菌，将此浓度定为 50 gL。用含 15 mlL 胎牛血清的 DMEM培养液配制含烟草浸提液的培养液，其浓度分别为0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25 和 50 gL 7 个浓度组。成骨细胞矿化培养液的配制:DMEM 培养基中加入双抗(含青霉素 100 U/ml 、链霉素100 U/ml)、10%胎牛血清、Na2CO3。含矿化液的 DMEM 培养基中加
10、入双抗(含青霉素 100 U/ml 、链霉素 100 U/ml)、10%胎牛血清、Na2CO3、甘油磷酸钠 110-2mol/L、维生素 C 50 mg/ml、地塞米松 110-7mol/L。孵育液含 3% 甘油磷酸钠 5 ml，2%巴比妥钠 5 ml，2%硝酸钙10 ml，2%MgSO4 5 ml，蒸馏水 25 ml。 1.2 实验方法 1.2.1 大鼠成骨细胞的原代培养：周龄 SD 大鼠处死后用 75酒精浸泡 5 min，倒置显微镜下取其颅顶骨，以无菌 DHanks( 含青霉素 100 U/ml 、链霉素 100 U/ml)冲洗，刮去骨膜、剪去骨缝间结缔组织，制成约 1.5 mm1.5 m
11、m 大小的碎块，以 DHanks 液冲洗 3 次，加入 0.25% 胰蛋白酶 37下震荡消化 20 min，弃上清，0.1%的 II 型胶原酶消化 30 min 后弃上清；所得骨块直接放入培养瓶中加入含 20% 胎牛血清的 DMEM 培养液，置于 37、5% CO2 培养箱中培养。 1.2.2 细胞培养及传代：在原代培养过程中，每 34 d 换液 1 次，细胞长满瓶底时开始传代，传代时用差速贴壁法进行纯化4 。0.25% 胰蛋白酶 37消化 10 min 左右，当观察到细胞形态变圆，且部分细胞已开始脱离瓶底时，终止消化，离心后加入培养液进行传代，每瓶细胞可传代 23 瓶。传代 35 次后，成骨
12、细胞得到纯化，用于实验。 1.2.3 成骨细胞鉴定：荧光倒置显微镜下对细胞形态的变化及生长状况每日进行观察。碱性磷酸酶组织化学染色(改良 Gomori 钙钴法) 将纯化后的第 2 代细胞接种于盖玻片上，接种密度为 1104 /cm2。待细胞长至汇合后取出盖玻片，以常规 Gomori 钙钴法染色。玻片无菌冲洗 2次后用冷丙酮（4冰箱保存）固定细胞 10 min，蒸馏水冲洗数次，放人孵育液中 37孵育 46 h，然后依次入 2硝酸钴 5 min，蒸馏水冲洗数次。1%硫化铵中浸 2 min，自来水冲洗，自然晾干，甘油明胶封片。将第 4 代成骨细胞接种爬片，用含矿化液的培养基培养 3 周，在倒置显微镜
13、下可见白色结节， PBS 冲洗 2 次，95%乙醇固定 10 min。再用 PBS冲洗 2 次，0.1%茜素红TrisHCl （pH 8.3）染色 30 min，用 PBS 冲洗，晾干、封片。 1.2.4 成骨细胞生长曲线的测定：取 3 瓶体外培养的成骨细胞，用适量 0.25%的胰蛋白酶消化 10 min，离心后加入 25 ml 培养基，吹打成细胞悬液后，计数板计数其浓度为 1.35105/ml。取 24 孔培养板 8 块，滴加细胞悬液入其内，每孔 0.1ml，培养 10 h 使成骨细胞能贴壁生长，测其贴壁率。而后每块培养板内各孔分别加入含不同浓度烟草浸提液的培养基 0.9 ml，每浓度组为
14、3 孔，细胞每 3 d 换液一次。从加入烟草浸提液始每 24 h 计数 1 次。 1.3 统计学处理 采用 SPSS13.0 软件包对数据进行双因素方差分析，实验数据用 xs 表示，P0.01 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 成骨细胞形态学观察 酶消化后对组织块继续培养 3 天，倒置显微镜下观察发现骨块周围有少量细胞长出，靠近骨块处圆形细胞多见，远离骨块处体积较小的梭型细胞常见；5 d 后观察，细胞数量较多，呈梭形、三角形或不规则多边形，分化成熟者可见有 34 个突起。传代后细胞以梭形、三角形为主，呈集落样生长趋势，最终可连接成片，出现重叠生长现象（图 1） 。 2.2 碱性磷酸酶（A
15、LP）组织染色 组织染色（改良 Gomori钙钴法）测定为阳性，显示成骨细胞呈黑灰色着色（图 2） 。 2.3 成骨细胞矿化结节茜素红染色观察 成骨细胞生长融合成复层后，不经传代继续培养，形成钙化结节后行茜素红染色，显微镜下黑色的结节染成红色 (图 3)。 2.4 烟草浸体液对成骨细胞的影响 2.4.1 成骨细胞的贴壁率：培养 10 h 后成骨细胞的贴壁率为1.125104/（1.35104）100%=83%。 2.4.2 成骨细胞生长曲线的测定：每 24 h 对对照组和实验组分别进行测定，每次每组测 3 孔，连续测 7 d。测得成骨细胞数值（表 1） ，并绘制成骨细胞生长曲线（图 4） 。通
16、过对表 1 所测数值进行双因素方差分析可显示：各处理组间比较差异有显著性（Fst1=5.228,Pst10.01） ；组内不同时间比较亦有显著性差异（Fst2=46.696,Pst20.01） ，但较高烟草浸提液浓度的后 5 组第 47 天间比较无统计学差异（P0.05） 。提示烟草浸体液对成骨细胞的附着和生长起抑制作用，且随其浓度的升高抑制作用增强。表 1 成骨细胞生长曲线测定值 3 讨论 3.1 成骨细胞的来源、分离及培养 成骨细胞的培养方法有两种：酶消化法和组织块法。酶消化法是通过用胶原酶和胰蛋白酶处理组织块来收集细胞，此法可获得大量细胞，但有细胞膜损害大、细胞死亡率高、体外活力差等缺点
17、5 。组织块法则是通过骨组织块的培养来收集成骨细胞的，此法简便、可靠，但需时长、产出率低、含成纤维细胞较多。本实验采用先对组织块进行酶消化，然后再对组织块进行培养，从而使获得的成骨细胞纯度较高、细胞损害小。实验中成骨细胞原代培养的关键是：酶消化时间适宜、骨块去除及时、传代适时、差速贴壁法纯化细胞等。 3.2 成骨细胞的生物学特性 成骨细胞能利用 ALP 水解磷酸酯而释放出无机磷，其基质小泡可释放钙离子、合成和分泌胶原纤维、糖蛋白等类骨质成份从而具有了钙化能力。因而，成骨细胞的鉴定目前主要包括了形态学观察、ALP 活性、矿化结节测定等6 。形态学观察，在光镜下可见贴壁后的成骨细胞主要呈梭形或三角
18、形，胞核居中或偏于一侧，突起 24 个，并具有复层生长现象。细胞化学法则显示其碱性磷酸酶染色为阳性。当细胞生长出现聚集、多层重叠现象时，显微镜下可见多个大小不等的不透明区域，茜素红染色则呈阳性，证实其为钙化结节，进一步证明所培养细胞为成骨细胞。 3.3 烟草浸提液对成骨细胞的影响 烟草中已确认的成分有 4000多种，其中氮、氧、CO2 约占烟雾的 85%，其它则包括一些有毒物质如尼古丁、镉、羟基醌、硫氰酸盐、CO、亚硝胺等。至于烟草对成骨细胞的作用，体内实验证明烟雾能引起鼠骨小梁体积及表面矿化程度的下降，而骨小梁的矿化程度与成骨细胞的作用是密切相关的；体外实验也曾证明烟草确能破坏成骨细胞的增殖
19、、分化和功能7 。本实验分对照组和实验组两组进行，在成骨细胞加入培养板上培养 10 h 后测其附着率为 83%。而后在对照组仅更换培养液，实验组则加入不同浓度的烟草浸提液，继续培养 24 h 后测其细胞附着与开始时的相对比率，对照组为 118%，实验组按其烟草浓度由低到高分别为115%、89%、74%、63%、52%、34%、29%；由对照组和低浓度实验组细胞附着率的略有增加可见,细胞在实验开始后有继续贴壁生长的趋势，但烟草浸提液对其生长确有抑制作用。细胞的生长分为潜伏期、指数期、静止期三期8 。实验也显示，成骨细胞在前 3 d 生长缓慢，即处在潜伏期。第 4 天起细胞生长速度加快，对照组、0
20、.8 g/L 和 1.6 g/L 组尤其明显，此即为指数生长期。通过对此 3 组细胞在不同时间点所测数值的统计学分析可发现其有显著性差异（Fst=46.696,P0.01） ，说明细胞在无烟草浸提液和低浓度烟草浸提液情况下的生长是确定的；而 3.250 g/L组前 3 d 的变化虽有统计学意义，但对后 4 d 所测量数值进行组内比较却无统计学意义（P0.05） ，这说明细胞在加入高浓度烟草浸提液的起始状态下受抑制明显，而随后几天的变化却不显著。通过对照组和各烟草浸提液浓度组间的比较可发现，其差异性显著（Fst=5.228,P0.01） ，故提示烟草浸提液对成骨细胞的附着和生长起抑制作用，且随浓
21、度的升高其抑制作用增强。因此口腔种植患者在术后应尽量戒烟，至少在骨愈合期间必须戒烟，这样口腔种植体的临床愈合才能在术后得到保证。 【参考文献】 1 尹美珍，李世普，袁琳. 用多次酶消化法体外培养的大鼠成骨细胞及其鉴定J.生物骨科材料与临床研究，2005，2(5)：1517. 2 刘莉，常红，黄国伟，等. 体外培养大鼠成骨细胞实验模型的建立J.天津医科大学学报，2004，10(1)：39 42. 3 金闻博，戴亚烟草化学M 北京：清华大学出版社，1994：23l236. 4 薛庆善体外培养的原理与技术M.北京: 科学出版社,2001：485488. 5 陈超，李光辉，陈安民含胎牛血清胶原酶消化法培养兔成骨细胞J 中国矫形外科杂志，2004，12(9)：683685 6 裴国献组织工程学实验技术M 北京：人民军医出版社，2006：61 7 Kartsogiannis V,Kongwah NG.Cell lines and primary cell cultures in the study of bone cell biologyJ.Mol Cell Endocrinol,2004，228(12):79102 8 张卓然培养细胞学与细胞培养技术M.上海：科学技术出版社，2004：1213.
