1、氧化苦参碱减轻大鼠肝纤维化的机制研究摘要 目的 探讨氧化苦参碱（oxymatrine，OM）减轻四氯化碳诱导肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）的机制。 方法 建立四氯化碳诱导的大鼠 HF 模型，制备氧化苦参碱脂质体（Oxymatrine liposomes，OM-liposome） 、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arginine-Glycin-Aspartic acid，RGD）三肽序列偶联的 OM 及异硫氰酸荧光素（fluorescent isothiocyanate，FITC）标记的 OM-liposome 和 RGD-OM-liposome。分离 HF 大鼠的肝脏星状细胞（
2、hepatic stellate cells，HSCs）并体外培养：将 OM-liposome、RGD-OM-liposome 和 RGD偶联的空白脂质体（RGD-liposome）作用于 HSCs，利用透射电镜检测HSCs 的细胞亚显微结构（凋亡小体）变化，利用流式细胞技术检测 HSCs的细胞周期，利用台盼蓝染色检测 HSCs 的细胞活性。将 FITC-OM-liposome 和 FITC-RGD-OM-liposome 作用于 HSCs，利用荧光显微镜技术比较两种剂型 OM 在 HSCs 中的分布。 结果 与 RGD-liposome 比较，OM-liposome 可促进 HSCs 凋亡小
3、体形成，增加 HSCs 凋亡，降低 HSCs 的细胞活性；与 OM-liposome 比较，RGD-OM-liposome 可进一步增加 HSCs内凋亡小体，促进 HSCs 凋亡，降低 HSCs 活性。RGD 可促进 OM-liposome 在 HSCs 内的分布。 结论 OM-liposome 可在体外诱导 HSCs 凋亡，RGD 可促进 OM-liposome 在 HSCs 的分布，进一步促进 HSCs 的凋亡。诱导 HSCs 凋亡可能是 OM 减轻肝纤维化的重要机制。关键词 氧化苦参碱；脂质体；精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸；肝纤维化；肝星状细胞氧化苦参碱（oxymatrine，OM）是从传统
4、中药豆根槐属植物苦参或豆科植物苦豆子、山根豆中提取的主要活性成分，是一种四环喹嗪啶类生物碱。近年来研究发现，氧化苦参碱对乙型肝炎、丙型肝炎、肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）及肝癌都具有较好的疗效1，作用机制目前尚不清楚。各种慢性肝损伤均可发展至 HF，目前认为 HF 是对创伤的一个修复过程，在此损伤修复的反应中，细胞外基质（extracellular matrix，ECM） 、肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）和细胞因子共同参与发挥了纤维化的作用2。越来越多的研究证实，HSCs 的活化、增殖在 HF 的形成和发展过程中起着重要作用，抑制 HS
5、Cs 的活化及诱导 HSCs 的凋亡对有效控制肝纤维化起到至关重要的作用。研究证实，OM 对其他器官组织损伤、纤维化3及肿瘤都有一定的治疗效果，其中，OM 抑制细胞凋亡是其减轻胰腺癌的重要机制4。因此，笔者猜测 OM 抑制 HSCs 活化、诱导 HSCs 凋亡可能是其治疗 HF 的重要机制，现将研究报道如下：1 材料与方法1.1 实验动物与试剂清洁级 SD 大鼠，体质量约 200 g（第四军医大学） ，大豆卵磷脂（天津远航化学品有限公司） ，胆固醇（北京奥博星生物技术责任有限公司） ，甲醇（西安化学试剂厂） ，氯仿（西安化学试剂厂） ，98.9%氧化苦参碱（西安大河药业有限责任公司） ，异硫氰
6、酸荧光素（FITC，陕西博微生物试剂公司） ，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD） 序列（陕西博微生物试剂公司） ，碘化丙啶（PI，陕西博微生物试剂公司） ，胶原酶（美国 Sigma 公司） ，密度梯度离心介质 Nycodenz（美国 Sigma 公司）， DMEM 培养液（美国 Gibco 公司） ，小牛血清（美国 Gibco 公司） ，胰蛋白酶（美国 Gibco 公司） 。1.2 方法1.2.1 制备氧化苦参碱脂质体（逆相蒸发法） 将大豆卵磷脂 5.0 g、胆固醇 2.5 g，溶于 50 mL 氯仿-甲醇混合液中，70水浴挥干溶剂，加入油酸 0.5 g，聚山梨酯 2.
7、5 g，搅拌融化。另将氧化苦参碱 1.5 g、聚乙烯吡咯烷酮 2.5 g 溶于 pH 7.4 磷酸缓冲液中，水浴加热至 70。将两者混合，恒温搅拌，灌装，密封，超声乳化，所得乳剂在旋转蒸发仪上减压蒸除有机溶剂，然后再进行短时超声，即得乳白色氧化苦参碱脂质体（Oxymatrine liposomes，OM-liposome） 。1.2.2 制备精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸偶联的氧化苦参碱脂质体 按101 摩尔比加入 RGD，室温震荡过夜，得到 RGD 修饰的氧化苦参碱脂质体（RGD-OM-liposome） ，冰浴下旋涡震荡 30 min，通过凝胶柱（CL-4B） ，层析法除去未偶连的脂质体。1.2
8、.3 制备 RGD 偶联的脂质体 按照“1.2.1”中的方法制备脂质体（不加入氧化苦参碱） ，随后按照“1.2.2”中方法将 RGD 与脂质体偶联。1.2.4 异硫氰酸荧光素标记药物 用分析天平准确称取所需的 FITC，按 1001 比例缓慢加入于 RGD-OM-liposome 及 OM-liposome 中，不停地搅拌 510 min，避免将荧光素黏于三角烧瓶壁或搅拌玻璃棒上，然后继续搅拌 1218 h 后，溶液以 2 500 r/min 离心 20 min，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中再置于烧杯中，于 4冰箱中过夜，得到 FITC-RGD-OM-liposome 及 FITC-OM
9、-liposome。1.2.5 动物模型的制备和肝星状细胞的分离、培养5 雄性 SD 大鼠，体重约 200 g，食用标准饲料，饮自来水。四氯化碳肝纤维化模型制备：8 周末，腹腔麻醉大鼠，皮肤消毒后切开，充分暴露肝脏，门静脉插管，同时剪开下腔静脉，用含肝素 12 500 U 的 D-Hanks 液灌注，待肝脏变为黄白色时，灌以 0.05%型胶原酶消化，约 40 min 肝组织完全软化后，停止灌注，离体肝脏并剪碎，以尼龙网过滤，D-Hanks 液冲洗，将滤过的细胞悬液移入 50 mL 离心管，吸管吹打，离心（ 450 g，5 min） ，弃上清，以 D-Hanks 液重悬，混以 Nycodenz
10、液，吸管吹打，转至离心管，并覆以 D-Hanks 液离心（1 450 g，16 min） ，取界面细胞，用 DMEM 重悬，再离心（500 g，7 min） ，弃上清，收集细胞。将刚分离的重悬细胞接种于培养瓶，在 5% CO2，37，95%潮湿空气的 CO2 培养箱里培养 48 h 后，换 10%小牛血清，3 d 后首次换液，以后视情况每 23 天换液 1 次。1.2.6 荧光显微镜观察 OM-liposome 在大鼠体内的靶向作用 将一部分 HSCs 接种于 24 孔板上，细胞密度为 5 l05/mL，待贴壁后，以 0.25% FBS-DMEM 培养，95%潮湿空气的 CO2 培养箱里过夜，
11、实验前弃去原培养液，荧光显微镜观察药物在 HSCs 内的分布。1.2.7 细胞活性检测 细胞经消化后，反复吹打使其成为细胞悬液，稀释到细胞浓度为 106/mL，吸取约 1 mL 细胞悬液至离心管中，加入 1 滴台盼蓝并轻轻摇匀，在约 3 min 内对所有细胞进行计数。死细胞被台盼蓝染成蓝色，而活细胞则为无色，并根据公式计算活细胞率：活细胞率=（活细胞数/细胞总数）100%。1.2.8 实验分组 将生长良好的 HSCs 用 0.25%的胰蛋白酶消化后，接种于 24 孔培养板中，细胞浓度为 2107 个/孔，每 8 个孔中分别加入0.5 mg/mL RGD-OM-liposome；OM-lipos
12、ome 以及 RGD 修饰的空白脂脂质体（RGD-liposome） ，并设对照组。1.2.9 流式细胞仪分析 HSCs 凋亡情况 各剂型药物作用 24 h 后，细胞以胰酶消化，PBS 清洗，将细胞悬液离心（8001 000 r/min，5 min） ，弃上清液，加 1 mL PBS，缓慢加入-20预冷的 95%乙醇 15 mL，使其终浓度为 70%，冰浴 30 min，4过夜；加入等量 PBS 再洗 2 次，65 mg /L碘化丙啶（PI）避光， 4显色 1 h，流式细胞仪检测。1.2.10 电镜观察 HSCs 形态 取对数生长期的单层生长细胞，弃去瓶中培养液，用胰蛋白酶消化，将细胞移入 1
13、0 mL 离心管中，加 4预冷的PBS 至 10 mL，吹打均匀，离心（2 000 r/min，15 min）弃上清，加入4预冷的 2%戊二醛 4 mL，4固定 2 h，PBS 漂洗 3 次，每次 10 min，1%四氧化锇 4固定 30 min，PBS 漂洗 3 次，用 50%丙酮溶液室温下脱水 10 min，弃脱水剂，加 3 mL 包埋剂包埋（按体积 11） ，室温下静置 30 min，弃去包埋剂，加纯包埋剂 1 mL，室温过夜后，将明胶注满混合包埋剂，60烤箱烘烤 24 h，使标本固化为硬块，切片后电镜下观察细胞形态。2 结果2.1 各组凋亡小体形成情况将模型大鼠肝组织中分离获得的 HS
14、Cs 在体外培养，分别加入 RGD-liposome、OM-liposome 和 RGD-OM-liposome，利用透射电镜观察 HSCs胞内凋亡小体的形成。结果发现，OM-liposome 可促进 HSCs 胞内凋亡小体的形成；RGD 则可进一步增加 OM-liposome 诱导 HSCs 凋亡小体形成的作用（图 1） 。2.2 各组凋亡情况比较将模型大鼠肝组织中分离获得的 HSCs 在体外培养，分别加入 RGD-liposome、OM-liposome 和 RGD-OM-liposome，利用流式细胞技术检测HSCs 细胞凋亡情况。结果发现，OM-liposome 可诱导 HSCs 凋亡
15、，抑制DNA 合成；RGD 则可进一步增加 OM-liposome 诱导 HSCs 凋亡、抑制 DNA合成的作用（图 2） 。2.3 各组细胞活性观察将模型大鼠肝组织中分离获得的 HSCs 在体外培养，分别加入 RGD-liposome、OM-liposome 和 RGD-OM-liposome，利用台盼蓝染色检测细胞活性。结果发现，随着浓度的不断升高，OM-liposome 可显著抑制 HSCs的细胞活性；RGD 则可增强 OM-liposome 抑制 HSCs 细胞活性的作用（图3） 。2.4 OM-liposome 和 RGD-OM-liposome 在 HSCs 中的分布情况观察将模型
16、大鼠肝组织中分离获得的 HSCs 在体外培养，分别加入 FITC-RGD-OM-liposome 和 FITC-OM-liposome，利用荧光显微镜观察。结果发现，RGD 可显著增加 OM-liposome 在 HSCs 中的分布（图 4） 。3 讨论OM 对肝纤维化具有较好的疗效1，然而其机制尚不清楚。HSCs 和细胞因子共同参与发挥了致肝纤维化的作用2。越来越多的研究证实，抑制活化的 HSCs、诱导 HSCs 凋亡对有效控制肝纤维化起着至关重要的作用。本研究中，笔者成功分离获得了 HF 大鼠肝脏 HSCs 并在体外培养；构建了 OM-liposome，并将其作用于体外培养的 HSCs。结
17、果发现，HSCs胞内凋亡小体形成增加，处于 DNA 合成期的 HSCs 百分比数量明显降低，细胞活性明显下降，提示 OM-liposome 可诱导 HSCs 凋亡。新型人工合成的 RGD 肽是一类含有 RGD 的短肽，是整合素与其配体结合的识别位点。由于细胞表面的整合素介导 ECM 与 HSCs 细胞膜受体结合，影响 HSCs 的生物学功能，RGD 能够竞争性与整合素结合，不但减少ECM 与 HSCs 黏附，还可作为 HSCs 的特异性配体6。本研究建立了 RGD-OM-liposome 并将其作用于体外培养的 HSCs，结果发现，RGD 可显著增加OM-liposome 在 HSCs 中的分
18、布。不仅如此，RGD 亦可显著增强 OM-liposome 增加 HSCs 胞内凋亡小体、减少处于 DNA 合成期的 HSCs 百分比及抑制 HSCs 细胞活性的作用。综上所述，本研究建立了 OM-liposome 和 RGD-OM-liposome，通过体外实验证实 RGD 可促进 OM-liposome 在 HSCs 中的分布，从而增强其诱导HSCs 凋亡的作用，提示 OM 可能通过诱导 HSCs 凋亡减轻肝纤维化。参考文献1 Shi GF，Li Q. Effects of oxymatrine on experimental hepatic fibrosis and its mechan
19、ism in vivo J. World Journal of Gastroenterology，2005，11（2）：268-271.2 Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis， an integrated cellular response to tissue injury J. J Biol Chem，2000，275（4）：2247-2250.3 Liu Y，Zhang XJ，Yang CH，et al. Oxymatrine protects rat brains against permanent focal is
20、chemia and downregulates NF-kappaB expression J. Brain Res，2009，1268：174-180.4 Ling Q，Xu X，Wei X，et al. Oxymatrine induces human pancreatic cancer PANC-1 cells apoptosis via regulating expression of Bcl-2 and IAP families， and releasing of cytochrome c J. J Exp Clin Cancer Res，2011，30：66.5 Kim MR，Kim HS，Lee MS，et al. Cell cycle protein profile of the hepatic stellate cells （HSCs） in dimethylnitrosamine-induced rat hepatic fibrosis J. Experimental molecular medicine，2005，37（4）：335-342.6 杜施霖，王吉耀，陆伟跃.含有 RGD 序列的环肽与大鼠肝星状细胞受体体外结合特性的研究J.中华肝脏病杂志，2005，13（5）：4
