1、液-质联用选择离子质谱法测定降糖中成药中添加格列本脲的含量【摘要】 目的建立液质联用(LC-MS)选择离子(SM)法对平糖宝胶囊中格列本脲的含量进行了测定。方法采用岛津 VP-ODS (150 L2.0，6012554) 色谱柱，流动相为 0.2%冰乙酸水溶液-乙腈(3070)，流速为 0. 2 ml / min;柱温为室温。结果格列本脲线性范围为0.8688.68 ng，回归方程为 Y=392 433X-101 195 ，r=0.999 7;平均回收率为 97.74%。同时测定了 4 种降糖中成药中格列本脲的含量。结论该法准确度高，重复性好，可作为本制剂的质控方法。 【关键词】 中成药; 格
2、列本脲; 液-质联用法; 选择离子质谱法近年来，一些不法分子擅自在中成药中添加化学药成分，造成快速起效的假象，降糖中成药中非法添加格列本脲的现象也屡见不鲜，由于格列本脲是第 2 代磺脲类口服降糖药的代表,其疗效特点为降糖作用强、持续时间长，对肝，肾等器官的毒副作用较大，长期服用会对身体造成极大伤害1。因此这种制假行为，应予以严厉打击。目前，对于非法添加格列本脲的测定方法有多种，其中包括气相色谱法，高效液相色谱法等，但是这些方法大多灵敏度较低，选择性不强，而降糖中成药中所添加的格列本脲含量较低，为了检验中成药制剂中是否添加有格列本脲, 有必要建立快速、灵敏、准确、可靠的分析方法。本文采用兼具高分
3、离、高灵敏度的 LC-MS 联用技术，建立了降糖中成药中非法添加格列本脲的含量测定方法。HPLC-MSn 是研究复杂样品成分分析很有效的方法。可在一级质谱条件下获得很强的待测物准分子离子峰, 几乎不产生碎片离子, 并且可借助 MSn ( n= 210) 准分子离子进行多级裂解, 进而获得丰富的结构信息。在复杂样品分析中, HPLC-MS 具有灵敏度高、专一性强等独特的优势25。SIM 检测法是基于在色谱保留时间范围内选择每个药物原型或其代谢物各自的若干特征离子, 进行选择离子扫描6。在选用液-质联用选择离子法的试验条件下格列本脲可与其他干扰成分达到很好的分离，而且最低检出量为 0.8 ng。可
4、满足有效测定降糖药中格列本脲的要求。本法准确度高，重复性好，为打击制售假药的违法犯罪行为，净化药品市场，保障人民用药安全提供了有效的技术依据。1 材料1.1 样品来源市售，平糖宝胶囊(批号：20080908)。1.2 仪器与试药日本岛津液质联用仪。格列本脲对照品由中国药品生物制品检定所提供;乙腈为色谱纯试剂;冰乙酸为分析纯试剂;水为超纯水。2 方法与结果2.1 液-质联用条件2.1.1 质谱检测模式为电喷雾离子化(ESI)方式，选择性离子检测(SM)、检测离子为负离子、m/z=492，干燥气流量为 10L/min，雾化气流量为 1.5 L/min，检测电压为 1.5 KV，源电压为 4.5 K
5、V，毛细管温度为 250，干燥气温度为 200。2.1.2 色谱条件岛津 VP-ODS column (150 mm2.0，6012554);流动相为 0.2%冰醋酸水溶液-乙腈(3070);流速为 0.2 ml/min;柱温为室温。2.2 试验条件的选择2.2.1 检测方法的选择由于中成药中所添加化学药品的成分含量较低，紫外等检测器的灵敏度较低，使分析很难进行，而质谱检测器兼具高分离和高灵敏度的特点，且检测专属性强，可获得理想的色谱峰，因此采用质谱检测方法进行定量分析，具有较好的准确度。2.2.2 流动相的选择参考文献资料7，以 0.2%冰醋酸水溶液-乙腈(3070)为流动相可使格列本脲与其
6、他成分达到基线分离，且峰形较好，故选择该流动相。2.2.3 提取条件的选择分别考察了甲醇超声提取、甲醇与流动相的混合液超声提取、0.02 mol/L 乙酸铵-0.1%乙酸水溶液-乙腈-甲醇(602020)超声提取等 3 种方法对含量的影响。结果见表 1。表 1 不同提取条件的测定结果2.2.4 提取时间的选择分别考察了超声提取 20，30，40 min 3 种提取时间对含量的影响。结果见表 2。表 2 不同提取时间的测定结果2.3 含量测定2.3.1 对照品溶液的制备精密称取格列本脲对照品适量，加甲醇制成每毫升含 0.8 g 格列本脲的溶液，即得。对照品质谱见图 1，对照品的 LC-MS 图谱
7、见图 2。图 1 格列本脲对照品质谱图 图 2 格列本脲对照品 LC-MS 图谱2.3.2 供试品溶液的制备 取本品装量差异项下的内容物，研细，取粉末约 0.3 g，精密称定，置 50 ml 量瓶中，加入甲醇约 20 ml，超声处理 30 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，再精密吸取续滤液 5 ml 置 50 ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。供试品 LC-MS 图谱见图 34。2.3.3 测定法 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 5 l，分别注入液相色谱仪，测定，即得。供试品 Lc-MC 图谱见图 34。图 3 表明平糖宝胶囊中非法添加格列本脲，图 4 表明糖乐胶囊中不含
8、格列本脲。图 3 供试品平糖宝胶囊 LC-MS 图谱图 4 供试品糖乐胶囊 LC-MS 图谱2.4 方法学考察2.4.1 线性关系考察精密称取格列本脲对照品适量，加甲醇制成每毫升含 0.8 g 格列本脲的溶液，即得。分别精密吸取该溶液1，2，3，5，7，10 l，注入液相色谱仪，测定峰面积值。结果对照品峰面积 Y 与其进样量 X(ng)之间呈良好的线性关系，线性范围及回归方程见表 3，回归曲线见图 5。相关系数 r=0.999 7 表明线性良好。表 3 标准曲线结果图 5 格列本脲标准曲线图2.4.2 精密度实验精密吸取供试品(批号：20040908)溶液，连续进样实验 5 次，记录格列本脲峰
9、面积积分值。结果见表 4。RSD=1.04%，结果表明精密度良好。表 4 精密度实验结果2.4.3 稳定性实验精密吸取供试品(批号：20080908)溶液，分别于 0，3，6，9，12 h 进样，记录格列本脲峰面积积分值。结果见表5，RSD=0.84%。结果表明供试品溶液在 12 h 内稳定。表 5 稳定性实验结果2.4.4 重复性实验取供试品(批号：20080908)5 份，分别按含量测定项下方法操作并测定含量。结果见表 6。格列本脲含量的平均值为0.523mg/粒，RSD 为 2.86%。表明实验重复性较好。表 6 重复性实验结果2.4.5 回收率实验采用加样回收法，精密称取已知格列本脲含
10、量的供试品(批号：20080908)5 份，分别精密加入格列本脲对照品适量，按含量测定方法测定，计算回收率。结果见表 7。表 7 回收率实验结果2.4.6 样品含量测定按上述“2.3”项下方法操作，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 5 l ，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表 8。表 8 含量测定结果本文建立的 LC-MS 方法，采用选择性离子检测(SIM)，试验结果表明，样品中杂质对格列本脲无干扰，样品峰形良好，最低检测限达到0.8ng，平均回收率为 97.74%，并且样品前处理程序简单，结果准确，专属性好。因此本方法为打击在降糖中成药中擅自添加西药成分格列本脲的违法行为提供了有利的技
11、术依据。【参考文献】1 朱才娟,陶 霞,邓渝林,等.14 种口服降糖药治疗糖尿病的成本- 效果分析J.中国药房,2004 ,15 (1) :321.2 WILLIAMSJ D ,BURINSKYDJ . Mass spectrometric analysisof complex mixtures then and now: the impact of linking liquid chromatography and mass spectrometryJ.International J Mass Spectrometry , 2001 ,212 (1 - 3) :111.3 CHAN S A
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13、y LC/MS/MSJ. J Pharmaceutical and Biomedical Analysis ,2002 , 30 (1) :161.5 JONG T T,LE M R , HSIAO S S. Analysis of aristolochic acid in nine sources of Xixin , a traditional Chinese medicine ,by liquid chromatography/ atmospheric pressure chemical ionization/ tandem mass spectrometry J.J Pharmaceutical and Biomedical Analysis , 2003 , 33 (4) : 831.6 张长久，崔凯荣，徐友宣，等.色质联用选择离子检测法在兴奋剂检测中的应用J.质谱学报，1991，13(3)：33.7 李小天，王广基，王素军，等. LC-MS 测定人血浆中格列本脲及其在健康志愿者中的药代动力学J.中国药科大学学报，2004，35(6)：532.
