1、应用激光解吸电离飞行时间质谱技术筛选无精子症患者精浆差异蛋白作者：刘池波，梁勇，潘春琴，张瑾【摘要】 目的:用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）分析无精子症和正常人精浆蛋白指纹图谱的变化，建立能鉴别无精子症和正常人精浆标志物的诊断模型。方法:收集 33 例无精子症和31 例正常人的精浆，用 H50（疏水芯片）蛋白质芯片和 SELDI-TOF-MS 检测蛋白质质谱的表达。用 Biomarker Patterns Software 分析软件进行数据处理，建立区分无精子症和正常人精浆中蛋白质谱差异表达模型。结果:在分子量 2 00020 000 范围内，共检测到 78 个
2、有差异的蛋白峰，其中 12 个差异有显著性（P 0.01） ，建立了由 3 个差异蛋白组成的无精子症诊断模型，其诊断灵敏度为 96.9%（32/33） ，特异性为96.7%（30/31） 。结论:用 SELDI-TOF-MS 技术初步建立的区分无精子症和正常人的精浆蛋白差异表达模型可以区别无精子症和正常人，可能为无精子症的诊断提供新的手段。 【关键词】 芯片分析技术；无精子症；蛋白质Abstract: Objective: To analyze the spectrometric semen protein profiling of azoospermatism and healthy con
3、trols by surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （ SELDI-TOF-MS） ， to establish semen marker pattern for the diagnosis of azoospermatism. Method: The semen samples in 33 cases of azoospermatism and in 31 cases of healthy controls on H50 proteinchip were collecte
4、d，the spectrometric protein profiling was detected by SELDI-TOF-MS， the data were analyzed by Biomarker Patterns Software provided by Ciphergen Corp. A primary diagnosis model of azoospermatism was set up. Result: Seventy-eight protein peaks were detected at the molecular range of 2 00020 000 Da， am
5、ong which 12 ones were significantly different between azoospermatism and controls（P 0.01）. A diagnostic pattern consisting of 3 protein peaks was established with sensitivity of 96.9% （32/33） ， specificity 96.7% （30/31）. Conclusion: It is successful to develop and evaluate the different spectrometr
6、ic protein profiling patterns of azoospermatism and healthy control by SELDI-TOF-MS. This affords possibly a new method to diagnosis of azoospermatism.Key words: microchip analytical procedures；azoospermatism；protein无精子症是男性不育领域中最常见的疾病之一，其病因及发生机制尚未完全明确，因此有待加强病因学和特异性诊断标志物的研究。本研究采用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术(s
7、urface-enhancedlaser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)结合 H50 蛋白质芯片对无精子症患者精浆进行研究，探索其精浆中的蛋白质指纹图谱，希望发现一些特异性的蛋白质，从而对无精子症的病因、诊治有所帮助。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 样本：所有无精子症精浆标本取自 2007 年 6 月至 12 月间来本院男性科就诊的人群，共 33 例。无精子症患者精液标本经 3 000 r/min 离心 15 min，沉淀镜检无精子。正常对照组 31 例来源于健康体检者，精液常规及特
8、殊生化检查均正常。无精子症组平均年龄（29.74.8）岁，正常对照组平均年龄（30.24.4）岁，两组间年龄匹配。所有的精液标本均在禁欲 35 d 取出，离心分离精浆 1 ml 后储存于-80 低温冰箱中。1.1.2 试剂及芯片: 乙腈、三氟乙酸、尿素、蛋白酶抑制剂、Hepes、Tri-HCl、CHAPS 和 OGP 均购自 Sigma 公司。H50 蛋白质芯片和阴离子交换柱（Hyper Q DF）购于美国 BIO-RAD 公司。1.1.3 蛋白质芯片阅读机: 蛋白质芯片阅读机（美国 Ciphergen公司生产 PBSII-C 型）是基于激光解吸离子飞行时间质谱的原理，检测范围从 1 kD 小
9、分子物质和多肽到 500 kD 以下的大分子。1.1.4 蛋白质芯片: H50 蛋白芯片专门用于结合蛋白或多肽通过反向或疏水性相互作用。其类似于 C6-C12 烷基层析吸附剂。当使用 H50表面时，蛋白利用其疏水性保留在芯片表面。H50 的选择性通过binding/washing 溶液中的有机溶剂的数量和（或）盐浓度来决定。1.2 方法1.2.1 样本处理: 取 10l 精浆样品，加 20l 8 mol/L 尿素，于 4 以 400600 r/min 振摇 30 min，吸取上清用于蛋白质芯片检测。1.2.2 芯片处理: 用 10l 10 mmol/L HCl 预处理 H50 蛋白芯片上 A-
10、H 点 10 min，用 M-Q 水洗芯片 3 次，将芯片安装于 bioprocessor 上，芯片 A-H 点滴加 200l 结合缓冲液（10% ACN） ，室温下振荡孵育 5 min，弃掉液体，每点分别加 10l 精浆/尿素混合物和 90l 结合缓冲液，振荡孵育 30 min，弃掉液体，用 200l 洗脱缓冲液洗涤芯片 2 次，每次 5 min，卸去 bioprocessor，芯片用 M-Q 水洗涤 1 次，待芯片表面自然晾干后，各点加两次 0.5l SPA，芯片表面干后，用蛋白质芯片阅读机（PBSII-C 型）进行蛋白质谱分析。1.2.3 数据采集: 蛋白质芯片采用蛋白质芯片阅读机 PB
11、SII-C 型读取数据。 仪器每天用标准多肽和低于 200 kD 的蛋白质标准分子校正，系统的质量偏差为 0.1%。检测芯片时蛋白质芯片阅读机设置如下:激光强度为 195，检测敏感度为 9，优化分子质量范围为 220 kD，最高分子量达 150 kD，每个样品收集 64 个点，采用 Ciphergen proteinchip 3.0.2版本的分析软件自动采集数据，采用 Biomarker Wiz-ard 和 Biomarker Pattern 软件分析无精子症患者和正常人精浆的蛋白质谱差异并建立分类树模型。1.3 统计学处理方法 采用 Ciphergen protein- chip3.0 软件
12、对数据进行统计学处理。2 结果2.1 无精子症患者与正常人精浆蛋白质谱相比有 12 个差异蛋白 将正常人和无精子症患者精浆样品加样于 H50 蛋白质芯片上，采用SELDI-TOF（PBSII-C 型蛋白质芯片阅读机）分析，自动收集蛋白质峰，设有意义峰的最低信噪比为 5，最低出现频率阈值为 30%，再用Biomarker Wizard 软件对所有测得蛋白质谱统一进行标准化后，对患者和正常人精浆中蛋白质峰的数量和相对强度进行比较和统计分析，结果显示，每个谱图平均有 78 个蛋白质峰，与正常人精浆蛋白质谱相比，无精子症患者精浆中有 5 个标志分子稳定上调，7 个标志分子稳定下调（见表 1） 。2.2
13、 分类树模型的建立及检测结果 采用 Ciphergen 公司Biomarker Pattern 软件对来源于 Biomarker Wizard 的数据进行处理，结果显示，没有一个单独的标志蛋白能将无精子症患者和正常人完全分开。进一步分析显示 9 939.6 Da 和 4 974.6 Da 两个标志蛋白被Biomarker Pattern 分析系统自动选取用以建立分类树模型，此分类树具有两层 3 个叶结点(见图 2)。64 例样本在根结点处(node 1)被 9 939.6Da标志蛋白划分成两组，峰值3.026 的 34 例样本被划分到左侧的枝结点 node 2 内，诊断为无精子症患者；峰值3.
14、026 的 30 例样本划分到右侧的叶结点 terminal node 3，诊断为正常人。node 2 的 34 个样本继续被 4 974.6 Da 标志蛋白划分，最终在叶结点 1（terminal node 1）中有 33 例样本，其中 32 例为无精子症，1 例为正常对照；叶结点2(terminal node 2)内 1 例为正常对照；叶结点 3 内有无精子症患者 1例，正常对照为 29 例。采用 9 939.6 Da 和 4 974.6 Da 标志蛋白组合样式建立的无精子症诊断模型，其划分上述样本的结果见表 2。此分类树的根结点为 9 939.6 Da，如样本在 9 939.6 Da 的
15、峰值强度为 3.026，则被分到左侧的枝结点 2 处，反之划分到右侧的叶结点 3 处；4 974.6 Da 标志蛋白的划分值为 2.952，最终此分类树形成 3 个叶结点，将 64 例样本分开。3 讨论无精子症的生物学行为多变，病因至今不明。大量的研究显示，无精子症的发生发展涉及多种疾病基因的突变或多种基因的失活，人们常采用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）法构建 cDNA 消减文库，结合高通量基因芯片技术，进行无精子症突变或缺失基因的遴选。然而，该方法技术要求高，步骤繁琐、耗时，更不适合大规模筛查。蛋白质是生命活动的直接执行者
16、，各种遗传信息最终要靠在不同时空、受严格调控并具有自身规律的蛋白表达来体现。人类虽在基因水平上已发现一些基因，但由于转录后剪切、翻译后修饰等使基因与蛋白质的关系绝非一一对应。蛋白质不仅种类及数量更多，而且又处于动态的新陈代谢之中，其修饰构象的变化与生命活动密切有关，相互作用也更为复杂。虽然酵母双杂交技术微量化、阵列化可用于大规模研究蛋白质的相互作用，但人们在检测某种蛋白与多种成分间的相互作用、在特殊环境下的相互作用、转录后的修饰、相互作用的动力学和实时检测等方面束手无策。因此,如何应用蛋白质组学从整体水平探讨疾病组织或细胞蛋白质的结构功能关系及其蛋白质间的相互作用，为阐明无精子症的发病机制提供
17、理论依据，则显得尤为突出。蛋白质芯片是近年来发展起来的新的生物检测技术1-3，通过全面分析体内蛋白质的变化，了解疾病状态下的蛋白质表达谱，可发现与疾病相关的一种蛋白质或生物标志物或一组蛋白质4-7。我们采用 H50 蛋白质芯片对 33 例无精子症患者和 31 例正常人精浆进行了蛋白质谱分析， Biomarker Wizard 分析结果显示两组之间有12 个差异蛋白(标志分子)，其中 5 个标志分子在无精子症患者精浆中呈高表达，7 个标志分子在无精子症患者精浆中呈低表达。进而采用Biomarker Pattern 软件对所获得的数据做了进一步分析，分析系统从上述的差异蛋白中自动选取 2 个标志分
18、子 9 939.6 Da 和 4 974.6 Da 用于建立分类树模型。本实验所建立的无精子症分类树模型结构简单，两层 3 个叶结点。即采用 9 939.6 Da 和 4 974.6 Da 共同检测上述样本时，划分正确率达到 96.7%和 96.9%。使用组合式样建立诊断模型具有一定的优越性，至少在两个方面具有或反映了生物学依据: 一是因为任何疾病的发生和发展，不可能由细胞内一种蛋白质发生改变所引起，很可能是一些或一组相关联的蛋白质发生了变化才会引发疾病。 这些与疾病发生相关的蛋白质或肽，或其代谢产物，或可溶性的膜抗原成分可释放入体液，因此通过比较患者和正常人样本的蛋白质谱变化，可能会找出某种
19、独特的标志蛋白的组合样。正是蛋白质组学的发展，为这种组合式样的获得提供了必要的技术基础，可以预测， 随着蛋白质组检测技术在灵敏度和分辨率上的不断提高，利用这种全景式筛选的技术从标本中筛选出的疾病标志蛋白，特别是其组合的式样今后将会更广泛地应用于临床疾病的诊断，其敏感性和特异性都会远远超过目前临床所采用的常规检测。本实验是在小样本量的情况下得出的结果，为了验证筛选出的标志蛋白的特异性和敏感性，我们将扩大检测的样本量，并对一部分样本进行盲筛。 随着样本量的扩大，将对 2 种无精子症的精浆蛋白质谱做进一步的分析，希望筛选出不同类型无精子症之间的标志蛋白，以期做出诊断和鉴别诊断，为无精子症的临床分子诊
20、断提供新的思路和方法。【参考文献】1 Liang Y,Fang M,Li J,et al. Serum proteomic patterns forgastric lesions as revealed by SELDI mass spectrometryJ.Exp Mol Pathol,2006,81(2):176-180.2 梁勇,潘春琴,杨林军，等.血清蛋白质指纹图谱模型在胃腺癌诊断中的应用J.中华检验医学杂志,2004,27(9):576-577.3 Pertricoin EF,Ardekani AM,Hett BA,et al. Proteomicapproaches to biom
21、arker discovery in prostate and bladdercancersJ.Pro,2001,10:1264-1270.4 刘池波,潘春琴,梁勇,等.表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱在胃炎诊断中的应用研究J.中华检验医学杂志,2007,30(2):178-179.5 刘池波,梁勇. 应用 SELDI-TOF-MS 技术建立胃癌筛选蛋白质指纹图谱模型J.医学研究杂志,2008,37(1):115-117.6 潘春琴,刘池波,梁勇.SELDI-TOF-MS 技术对胃炎诊断的应用J.浙江医学,2006,28(12):970-972.7 刘池波,潘春琴,孙灵芬,等. 血清蛋白质谱模型对肝硬化诊断的应用性研究J.中华检验医学杂志,2006,29(6):529-530
