1、诱生型一氧化氮合酶在白色和杂色豚鼠脉冲噪声损伤耳蜗中的表达作者：何青莲 ,熊敏,李云英 石灵春 ,谭敏,李华【摘要】 【目的】 观察诱生型一氧化氮合酶(iNOS)在脉冲噪声暴露白色和杂色豚鼠耳蜗中的表达,以探讨黑色素对耳蜗损伤的保护作用机理。【方法】将白色和杂色豚鼠暴露于脉冲噪声,复制耳蜗损伤的模型。采用免疫组织化学的方法观察 iNOS 在两组豚鼠耳蜗的表达。 【结果】iNOS在两组脉冲噪声暴露豚鼠耳蜗中均呈阳性表达,以血管纹和螺旋神经节的表达较强,而且 iNOS 在白色豚鼠耳蜗的表达显著强于杂色豚鼠。 【结论】耳蜗黑色素拮抗耳蜗损伤的作用可能是通过抑制耳蜗 iNOS 表达来实现的。【关键词】
2、 耳蜗/损伤;耳蜗/病理学;脉冲噪声;黑色素;疾病模型，动物;豚鼠一氧化氮(nitric oxide, NO)有多种生物学作用,由 L 精氨酸在一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)的催化作用下产生。有研究表明诱生型 NOS(iNOS)参与噪声的耳蜗损伤机制1,而黑色素对杂色豚鼠耳蜗的损伤有拮抗作用2。目前有关黑色素拮抗豚鼠耳蜗损伤的机理尚不清楚3,本研究应用免疫组织化学方法观察 iNOS 在脉冲噪声暴露损伤白色和杂色豚鼠耳蜗的表达,以探讨黑色素是否通过抑制 iNOS 的表达而拮抗耳蜗损伤。现报道如下。1 材料与方法11 实验动物选用健康白色红目豚鼠(白色组)和
3、杂色豚鼠(杂色组)各8 只,耳镜检查鼓膜正常,耳廓反射灵敏。豚鼠来源于广东省医学实验动物中心,3 月龄,体质量 250 g 左右,雌雄兼用,合格证号：0017410。12 主要试剂与仪器抗 iNOS 抗体、链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化试剂盒(SA1022)均为 Sigma 公司产品。86 式自动步枪来源于广东省军区军训靶场，Pathfinder I 型听功能测试仪(Nicolet 公司)。13 造模方法4-5脉冲噪声发生源为 86 式自动步枪,脉冲噪声发生环境为军训靶场,将豚鼠置于距步枪口 15 cm 处,测得该处声压为 170 dB。步枪连续激发 6 发,每次激发间隙
4、 10 s。14 听觉脑干诱发电位(ABR)检测 ABR 阈值采用听功能测试仪记录,短声刺激,声音由耳机通过与豚鼠外耳道耦合的塑料小管输入,以第 3 波为基准测反应阈,测定脉冲噪声暴露前后听阈值。两组豚鼠在脉冲噪声暴露前及暴露后 24 h 行 ABR 检测。15 取材最后 1 次检测 ABR 后,豚鼠在全麻下开胸,以磷酸盐缓冲液(PBS)心脏灌流,在灌流液清亮时,改用 40 g/L 多聚甲醛灌注固定 5 min。迅速取下双侧颞骨,将耳蜗置于 4、40 g/L 多聚甲醛液中,在解剖显微镜下摘除镫骨,用细针于蜗顶钻一小孔,轻轻以 40 g/L 多聚甲醛灌流耳蜗,耳蜗在 40 g/L 多聚甲醛固定
5、12 h 以上,PBS 漂洗数次,100 g/L 乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙,石蜡包埋,切片,每片厚度 6 m。16 免疫组织化学染色两组豚鼠耳蜗切片以二甲苯及酒精脱石蜡后,Tris 缓冲盐溶液(TBS)漂洗 10 min3 次,体积分数 2%双氧水处理 20 min。TBS 漂洗 10 min2 次后,2 g/L Triton 处理 10 min。TBS 漂洗 10 min2 次,50 g/L 胎牛蛋白封闭 60 min。加抗 iNOS 抗体(以 8 g/L 胎牛蛋白稀释为 1800,Sigma 公司,从兔血清制备)，在 4冰箱过夜。加入二抗(羊抗兔, 用 TBS 稀释为 1400)1 h
6、,TBS 漂洗后加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(StrepHRP, 用 TBS 稀释为 1100)1 h,TBS 漂洗 10 min4 次后,用二氨基联苯胺(DAB)显色液显色,显色在光镜下控制进行。阴性对照以 8 g/L 胎牛蛋白代替抗 iNOS 抗体,以庆大霉素损伤豚鼠肾脏切片为阳性对照。iNOS 在两组豚鼠耳蜗的表达强度以+表示进行半定量分析6。17 统计学方法采用 SPSS 115 软件进行数据的统计学分析。2 结果21 两组豚鼠 ABR 听阈变化由表 1 可知,两组豚鼠在脉冲噪声暴露后 ABR 比较差异具有显著性意义(P001), 杂色豚鼠的平均听阈比白色豚鼠约低 17 dB 左右
7、。表 1 两组豚鼠 ABR 听阈变化比较22 两组豚鼠耳蜗 iNOS 表达比较iNOS 在两组豚鼠耳蜗反应均呈阳性,而且在耳蜗的各转都呈阳性,iNOS 在白色豚鼠耳蜗的表达明显强于杂色豚鼠。在 Corti 氏器,支持细胞如：Hensen 细胞、Deiter 细胞、内外柱细胞、边缘细胞 iNOS 反应均呈阳性。感觉细胞(内、外毛细胞)iNOS 染色呈阳性,外毛细胞染色较强,内毛细胞染色较弱。蜗神经的 iNOS 染色在光镜下呈阴性。图 1 结果显示：白色豚鼠耳蜗血管纹和螺旋神经节细胞 iNOS 反应均呈强阳性 (图 1-a,b),杂色豚鼠耳蜗血管纹和螺旋神经节细胞 iNOS 反应均呈弱阳性 (图
8、1-c,d)。iNOS 在两组豚鼠耳蜗的表达强度见表 2。表 2 两组豚鼠 iNOS 耳蜗表达强度比较3 讨论噪声能导致耳蜗的损伤,噪声引起耳蜗的损伤包括机械性和代谢性两种机制,一般认为先有机械性损伤,之后继发代谢性损伤。杂色豚鼠耳蜗黑色素能拮抗噪声对耳蜗的损伤作用,但是黑色素拮抗耳蜗损伤的作用机理不清楚3。研究证实 iNOS 是参与噪声耳蜗损伤的主要病理因素之一1。本研究结果表明在脉冲噪声损伤时 iNOS 在杂色豚鼠耳蜗的表达强度显著低于白色豚鼠耳蜗的强度,证明杂色豚鼠耳蜗黑色素通过代谢途径抑制 iNOS 活性,从而拮抗豚鼠耳蜗的损伤。iNOS 在脉冲噪声损伤耳蜗中表达阳性,尤以血管纹和螺旋
9、神经节细胞为甚。iNOS 在正常的组织中不表达,一旦在病理因素的刺激下表达则持续催化产生大量 NO7,而大量NO 则对组织产生损伤作用。另外,NO 与过氧化物反应产生过氧亚硝酸盐8-9,过氧亚硝酸盐能迅速解离氢氧根自由基,亦导致细胞损伤。同时,NO 能激活 N-甲基-D-天冬氨酸受体的负反馈机制,而导致内耳的神经阻滞10。豚鼠耳蜗在暴露脉冲噪声后血管纹和螺旋神经节 iNOS 的表达较强,从而产生大量 NO 而损伤血管纹和螺旋神经节细胞。血管纹是整个耳蜗包括内外毛细胞及支持细胞能量的主要来源11,血管纹的损伤导致耳蜗功能的失调。螺旋神经节细胞是听觉传导路的一级神经原,其损伤导致听觉传导的阻滞。综
10、上所述,脉冲噪声能引起耳蜗 iNOS 的表达,而杂色豚鼠耳蜗黑色素通过代谢途径抑制 iNOS 活性,从而拮抗脉冲噪声耳蜗的损伤。【参考文献】1Shi X, Nuttall A l. Upregulated iNOS and oxidative damage to the cochlear stria vascularis due to noise stressJ.Brain Res,2003,967(1-2)：1.2 朱明,黄以乐,龙孝斌,等。内耳色素与爆震性听损伤J听力学及言语疾病杂志,2000,8(3)：140.3 Bartels S, Ito S, Trune D R, et al. N
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