1、原位杂交法检测视网膜色素上皮细胞炎前因子 mRNA 的表达作者：宋宗明 惠延年 瞿佳 王雨生 马吉献 韩泉洪 杜红俊 【关键词】 色素上皮细胞 关键词: 色素上皮细胞;视网膜;原位杂交;炎前因子;mRNA 摘 要:目的 观察视网膜色素上皮细胞（RPE）在炎性介质刺激下炎前因子 mRNA 的表达. 方法 培养的人 RPE 经 IL-1（10gL-1 ）和脂多糖（1mgL-1 ）的刺激后，用生物素标记的寡核苷酸探针进行原位杂交，检测 RPE 炎前因子 IL-1，IL-6，IL-8 和 TNF-mRNA表达.杂交结果使用图像分析法进行比较. 结果 原位杂交显示 RPE 细胞质中均呈现浓淡不一的淡蓝色
2、着色，胞核不着色.其中 IL-6mRNA 在脂多糖刺激下染色较浅，增加脂多糖的剂量不能提高其表达.图像分析显示在IL-1（10gL-1 ）和脂多糖（1mgL-1 ）刺激下，RPE 表达 IL-6mRNA 的吸光度分别为 10818 和 3514，二者之间有显著性差异（P0.01）. 结论 在 IL-1 和脂多糖刺激下，人 RPE 可以表达炎前因子 IL-1，IL-6，IL-8 和 TNF- 的 mRNA. Keywords:retinal pigment epithelium;retina;in situ hy-bridization;proinflammatory factors;mRNA
3、Abstract:AIM To determine whether retinal pigment epi-thelium（RPE）expresses proinflammatory factors messenger RNA（mRNA）in cultured RPE cells stimulated by inflam-matory factors.METHODS Cultured RPE treated with IL-1（10gL-1 ）and lipolysaccharide（1mgL-1 ）was used as models.The presence of mRNA coding
4、for IL-1，IL-6，IL-8and TNFwas investigated by in situ hybridiza-tion（ISH）with biotin labeled oligonucleotide probes.Image analysis was performed to determine staining differences be-tween groups.RESULTS IL-1，IL-6，IL-8and TNF-mRNA positive cells showed light to dark blue staining in RPE cytoplasm afte
5、r being stimulated with IL-1and LPS.But IL-6mRNA showed light staining when RPE was treated with LPS，and greater dosage of lipolysaccharide（LPS）failed to enhance RPE mRNA expression.Image analysis showed that the optical densities of IL-6mRNA expression were10818and3514when RPE was respectively stim
6、u-lated with IL-1and LPS.The optical density value was sig-nificantly different（P0.01）.CONCLUSION The pres-ence of mRNA encoding for IL-1 ，IL-6，IL-8and TNF-is effectively detected by ISH in cultured human RPE stimulated with inflammatory factors. 0 引言 增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreo retinopathy，PVR
7、）是常见的致盲性眼病之一，其发病的分子机制是目前眼底病研究的热点1-3 .临床研究发现许多炎前因子 mRNA 和蛋白质在 PVR 膜中不同程度的表达，与 PVR 的发生明显相关，其中 IL-1，IL-6，IL-8 和 TNF- 在玻璃体切割液和 PVR 膜中水平较高4-8 .视网膜色素上皮细胞（reti-nal pigment epithelium，RPE）是 PVR 膜中的主要细胞成分，RPE 细胞移行、增殖和分泌胶原在 PVR 形成中可能起重要的作用1-8 .我们用原位杂交法观察培养 RPE 在炎性介质作用下炎前因子 IL-1，IL-6，IL-8 和 TNF-mRNA 的表达，以明确 RP
8、E 是否表达炎前因子的 mRNA，从而进一步了解 PVR 发生的分子机制. 1 材料和方法 1.1 材料 第 3 代 RPE 细胞由王雨生副教授惠增，培养条件为 37，50mLL-1 CO2 ，用含 100mLL-1 血清的 DMEM 培养.对近融合期细胞以 2.5gL-1 胰蛋白酶消化进行传代.选 68 代细胞用于实验.细胞培养主要试剂有:DMEM 培养基（Gibco 产品） 、胰蛋白酶（Sigma 产品）和小牛血清（杭州四季青产品）.将 18mm18mm 的盖玻片分成 4 小块，高温高压消毒后多聚赖氨酸包被.无菌玻片平铺于直径 10cm的培养皿中，将 200L 密度为 4104 mL -1
9、 RPE 悬液滴于的盖玻片中央，培养 4h 后补足培养液.细胞将近铺满时捞出玻片.终止培养前 6h 加入脂多糖（lipolysaccharride，LPS）1mgL-1 ，或者 IL-110gL-1 .切片用 PBS 漂洗 3 次，40gL-1 多聚甲醛固定 12h 干燥后-20保存. 1.2 方法 1.2.1 培养细胞的鉴定 取细胞铺片采用 SABC 法，进行抗人角蛋白免疫组织化学染色.鼠抗人细胞角蛋白单抗系 Dako 产品;SABC 试剂盒为博士德生物工程公司产品. 1.2.2 杂交探针 生物素标记 IL-1，IL-6，IL-8 和 TNF- 寡核苷酸探针产自上海基康生物技术公司，探针序列
10、分别为 IL-1:5-TCA TCC TCA TTG CCA CTG TAA TAA GCC ATC-3;IL-6:5-CTC ACT ACT CTC AAA TCT GTT CTG GAG GTA-3;IL-8:5-GTT GGC GCA GTG TGG TCC ACT CTC AAT CAC-3;TNF-:5-GCT GGG CTC CGT GTC TCA AGG AAG TCT GGA-38-10 .3Biotin 标记.原位杂交试剂盒由迈新公司提供. 1.2.3 原位杂交步骤 将细胞铺片放置于经洁净处理的载玻片上，23 滴新鲜稀释的蛋白酶 K，完全覆盖玻片边缘以保证充分消化蛋白质，37
11、，10min.PBS 漂洗 3min3 次.37，5min 孵育干燥.探针 95，5min 变性.置 1 滴探针于切片，盖玻片封盖.70，10min 变性 mRNA 二级结构.湿房孵育 37，34h 使探针与目标基因结合.37清洗液洗玻片直至盖玻片脱落.滴 12 滴 RNA 酶 A，37湿房孵育 30min.蛋白阻滞剂37，3min3 次.加 12 滴鼠抗生物素，37湿房孵育 40min.加 12滴生物素化羊抗鼠，37孵育 20min.清洗剂漂洗 5min.加 12 滴碱性磷酸酶-链霉蛋白结合物，湿房孵育 20min.加 12 滴底物室温孵育10min，直至完全显色.通过显微镜观察颜色的出现，
12、阳性地方出现蓝色.蒸馏水漂洗 23 次.过乙醇和二甲苯，树胶封片. 统计学处理:染色结果进行图像分析，方法是每组取 4 张切片，每张切片选 15 个细胞测定细胞质中的吸光度，以 x s 表示，用 t 检验进行比较. 2 结果 培养的 RPE 细胞抗角蛋白染色表现为几乎所有细胞胞质中呈现浓淡不一的棕黄色着色.在 IL-1 的刺激下，RPE 细胞 IL-1，IL-6，IL-8和 TNF-mRNA 表达表现为胞质中浓淡不一的紫蓝色（Fig1，2） ，而未经刺激的细胞则只有很少的细胞呈现淡蓝色.在 LPS 的刺激下 IL-6mRNA 表达量稍低（Fig3，4） ，增加 LPS 剂量至 20mgL-1
13、仍不能增加其染色强度. 图像分析结果显示在 IL-1 和 LPS 刺激下 IL-1（9715，10123） ，IL-8（10419，11119）和 TNF-mRNA（9021，10026）染色的吸光度没有明显差异（P0.05）.IL-1 和 LPS 刺激后 RPE 表达 IL-6mRNA 的吸光度为 10818 和3514，二者之间有显著性差异（P0.01）. 3 讨论 我们在研究中用原位杂交的方法对培养 RPE 进行检测，结果证实培养的人 RPE 在炎性介质刺激下可以表达 IL-1，IL-6，IL-8 和 TNF-的 mRNA.以往对于 PVR 的多数研究主要是利用酶联免疫吸附法和免疫组织化
14、学法检测患者的 PVR 膜和玻璃体液2-8 ，多数是针对炎前因子的蛋白质进行研究.也有少数用原位杂交的方法，但是体内实验无法表明其细胞来源.用 ELISA 和 RT-PCR 对于培养 RPE 的观察表明 RPE 可以表达 IL-1 等炎前因子11-15 ，但是这两种方法有其缺点，ELISA 法主要用于定量，对于无活性的物质也无法区别，RT-PCR 影响因素比较多，二者均不能进行细胞内原位观察. 我们用原位杂交方法对培养的 RPE 观察，既容易控制也可以进行原位观察，方法敏感.本研究观察到在 IL-1 或者 LPS 的刺激下，RPE 可以表达炎前因子的 mRNA，但是用 LPS 刺激细胞后 IL
15、-6mRNA 的染色较浅，与 IL-1 刺激后 IL-6mRNA 表达有显著性差异，说明 LPS 不是 IL-6mRNA的刺激因子.Elner 等11 和 Benson 等12 用 LPS 刺激 RPE 细胞，没有增加 IL-6 的 mRNA 表达，结果与本实验接近.PVR 的本质是机体对损伤的过度修复反应，是与炎症和免疫有关的以时相为的特征的程序化过程，大致可以分为炎症期、增生期和瘢痕期1 .炎症期 RPE 细胞分泌的细胞因子可能在趋化细胞移动、启动细胞增殖、分泌胶原和 PVR 形成的早期起重要的作用.在对大量玻璃体切割液的标本中发现 PVR 眼玻璃体腔中 IL-1，IL-6，IL-8 和
16、TNF- 等不同程度的升高.对于 PVR 眼视网膜前膜的观察也有类似的发现.据我们所知，PVR 的确切机制还不清楚，玻璃体中这些细胞因子的来源也不清楚.我们的研究结果显示在 IL-1 或者LPS 刺激后 6h，RPE 就会表达 IL-1，IL-6，IL-8 和 TNF- 的 mRNA，说明 RPE 在受炎性介质刺激的早期就能表达炎症早期的一些细胞因子.因此我们推测在孔源性视网膜脱离后，RPE 脱落游离于玻璃体腔中，通过自分泌和旁分泌 IL-1 等炎前因子，趋化巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞，引起修复性反应.关于细胞因子在炎症和免疫反应中的调节功能虽然已经有论述16 ，但是它们在 PVR 中的相
17、互关系还不明了.Kauffmann等17 和 Elner 等6 发现 IL-6 和 IL-8 在 PVR 眼的玻璃体中持续增高，由于 IL-8 的主要功能是白细胞趋化，所以我们认为可能 IL-1，IL-6 和 TNF- 不直接趋化白细胞，它们通过诱导 RPE 等分泌 IL-8和 MCP-1 等实现趋化作用.IL-1 和 IL-6 可能主要介导 RPE 移行、增殖和分化等，IL-1 又是 IL-6 的诱导剂，它们的功能相互交叉. 图 1 图 4 略 参考文献: 1Yannian H.Proliferative vitreoretinopathy:Topic brought into the21s
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