1、噪声暴露对豚鼠耳蜗 c fos 基因表达的影响作者：查定军, 薛涛, 乔莉 , 刘大顺, 高雪, 陈俊, 邱建华 【摘要】 目的: 观察噪声暴露后豚鼠耳蜗 cfos 基因表达的变化. 方法: 选用健康雄性白色豚鼠 32 只，随机分为 4 组，1 组为正常对照组，另 3 组为实验组. 实验组在 120 dB spL 的 4 kHz 窄带噪声中暴露 4 h, 分别测试噪声暴露后 2，48, 168 h 及对照组豚鼠听性脑干反应（ABR）. 用免疫组织化学染色分析 cfos 基因在耳蜗的表达情况，用计算机图像分析系统测量耳蜗 cfos 蛋白的平均吸光度值. 结果：噪声暴露后豚鼠ABR 阈值及耳蜗中
2、cfos 蛋白的平均吸光度值较正常组均增大；随着时间的延长 ABR 阈值及 cfos 蛋白的平均吸光度值均逐渐恢复，168 h 组的 ABR 阈值及 cfos 蛋白的平均吸光度值均低于 2 h 组和 48 h 组. 结论: 噪声暴露后耳蜗 cfos 基因表达增高，可能与噪声暴露后耳蜗毛细胞、螺旋神经节等结构的损伤修复有关. 【关键词】 cfos 基因；耳蜗；噪声；豚鼠【Abstract】 AIM: To investigate the changes of cfos expression in the cochlea of guinea pigs after noise exposure. M
3、ETHODS: Thirtytwo healthy male guinea pigs were randomly distributed into 4 groups: a normal control group, and 3 experimental groups. The experimental groups were exposed to 4 kHz narrow band noise at 120 dB spL for 4 h so as to induce the cochlea damaged animal model. Auditory brainstem response (
4、ABR) was test before and 2, 48, 168 h after noise exposure. Immunocytochemistry was used to detect the expression of cfos in all cochlea. The average optical density (A) of cfos in cochlea was measured with computer image analysis system. RESULTS: The threshold of ABR and A value of cfos in noise ex
5、posed cochlea were increased compared with the control cochlea (P0.01), and they were gradually reduced as the time went by. CONCLUSION: The increase of cfos expression in cochlea after noise exposure may be attributed to the damage and recovery of hair cell and spiral ganglion neuron in the cochlea
6、.【Keywords】 cfos; cochlea; noise; guinea pig0 引言细胞癌基因 cfos 是存在于人类、豚鼠和鸟类细胞核 DNA 中的基因片断，是一种细胞分化的诱导因子，对细胞的生长、分化及增殖起促进作用. 应激性刺激可引起神经系统 cfos 基因表达的增加，cfos 基因表达增加与继发性病理过程如细胞的损伤修复、凋亡有关1. 噪声刺激可引起耳蜗的损伤，导致暂时性或持久性听力阈移2. 我们通过建立噪声刺激后豚鼠耳蜗损伤模型，观察噪声刺激后豚鼠耳蜗内螺旋神经节、Corti 器等结构 cfos 基因表达的改变，了解噪声刺激对豚鼠耳蜗内 cfos 基因表达的影响，探讨 c
7、fos 基因表达与耳蜗损伤修复的关系.1 材料和方法1.1 材料 选用耳廓反射灵敏的健康白色红目豚鼠 32 只, 体质量 350400 g，雌雄不拘，由第四军医大学实验动物中心提供. 免疫组化试剂兔抗鼠 cfos 多克隆抗体（一抗）由美国 Santa Cruz 生物技术公司生产，IgG 浓度均为 100 mg/L. LSAB 试剂盒由美国 Sigma 公司生产，内配生物素标记鼠抗兔抗体（二抗）. 过氧化物酶标记链霉亲合素（streptavidin，SA） ，正常猪血清. DAB 显色试剂为美国进口粉剂，用蒸馏水配制过滤而成，现配现用.1.2 方法1.2.1 动物分组 将豚鼠随机分为 4 组，1
8、 组为正常对照组，另3 组为实验组，每组动物 8 只. 实验组在准自由声场中暴露于 120 dB SPL 1/3 倍频程的 4 kHz 窄带噪声中 4 h, 对照组置于自然安静环境中.1.2.2 听阈测试 对照组、实验组动物在噪声暴露前及噪声暴露后 2, 48, 168 h 检测豚鼠听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)阈值变化用以检测各组反应阈的改变. 豚鼠用 200 mL/L 乌拉坦(8 mL/kg)腹腔注射进行麻醉，卧位固定. 采用银制针形电极，记录电极置于两外耳道口连线与颅内正中线交叉处皮下，电极尖深达颅骨；参考电极置于给声侧外耳道口后下方 5
9、 mm 处皮下，刺激声为 click，重复率 20次/s，扫描周期为 10 ms，滤波带宽 1003000 Hz，信号叠加 1240 次，以 ABR 波 III 反应阈为标准判断听阈. 测试每只豚鼠的两耳各波反应阈. 测试数据由测试系统自身附带的微机自动读取、存储，留备分析.1.2.3 耳蜗取材与切片制备 各组动物用 200 mL/L 乌拉坦(8 mL/kg)腹腔注射进行麻醉，仰卧固定，开胸暴露心脏，灌流冲洗，随后灌注 40 g/L 多聚甲醛缓冲液 500 mL. 动物迅速断头处死，取出双侧听泡, 打开听泡暴露耳蜗, 挑开蜗尖及两窗膜，用 4 25 g/L 戊二醛+10 g/L多聚甲醛行耳蜗阶
10、内灌注固定，漂洗、过蔗糖，冰冻切片.1.2.4 免疫组织化学染色 免疫组化试剂兔抗鼠 cfos 多克隆抗体采用 LSAB 法行冰冻切片免疫组化染色，一抗工作浓度为 1150；二抗工作浓度 1300；DAB 显色 520 min. TBS 代替一抗作为阴性对照，作免疫组化阴性对照染色.1.2.5 结果观察与图像分析 在 Nikon 光学显微镜下观察耳蜗螺旋神经节、Corti 器免疫组织化学染色结果, 通过 Nikon coolpix4500 数码相机摄取耳蜗螺旋神经节、Corti 器免疫组织化学染色图像, 然后转存于计算机上. 用多功能真彩色病理图像分析系统, 测量耳蜗 cfos 免疫阳性染色的
11、平均吸光度蛋白免疫阳性染色的吸光度值 A 值.统计学处理：用 SPSS 10.0 软件进行统计处理，组间比较用方差分析及 LSDt 检验，P0.05 为差异有统计学意义.2 结果2.1 豚鼠听阈测听 以波 III 作为判断 ABR 阈值（dB SPL）的标准. 噪声暴露后 2 h 组（9613）, 48 h 组（879）, 168 h 组（528） ABR 阈值与对照组（285）相比，差异有统计学意义（P0.01）. 噪声暴露组中 2, 48 h 组与 168 h 组相比差异有显著统计学意义(P0.01).2.2 cfos 癌基因蛋白产物在豚鼠内耳的表达 Fos 蛋白样免疫反应阳性产物定位于神
12、经元细胞核内，为深褐色颗粒，呈圆形或卵圆形，但在核仁空泡区、胞浆和突起均无显色. 图像分析各组耳蜗不同部分的cfos 蛋白样免疫反应阳性产物的吸光度 A 值如表 1. 结果表明，实验组豚鼠内耳的螺旋神经节细胞、Corti 器内的毛细胞、支持细胞细胞核均呈 Fos 蛋白样免疫反应阳性；对照组部分豚鼠内耳可疑阳性. 噪声暴露后，螺旋神经节、corti 器的 cfos 蛋白样免疫反应阳性产物的吸光度A 值均高于正常对照组. 噪声暴露后，耳蜗 cfos 蛋白样免疫反应阳性产物的吸光度 A 值在 2 h 组最高，随后逐渐下降，噪声暴露后 2, 48 h组，螺旋神经节、corti 器的 cfos 蛋白样免
13、疫反应阳性产物的吸光度A 值高于 168 h 组.表 1 噪声暴露后耳蜗 cfos 蛋白样免疫反应阳性产物的 A 值（略）bP0.01 vs 对照； dP0.01 vs 噪声暴露后 168 h.3 讨论本实验结果表明，噪声暴露后豚鼠 ABR 阈值经历了急剧增大到部分提高恢复的过程，说明本噪声条件可使豚鼠部分的听力阈移恢复. 噪声暴露后豚鼠耳蜗内 cfos 蛋白样免疫反应阳性产物的表达也经过一个急剧增强到逐渐减弱的过程，cfos 蛋白样免疫反应阳性产物的表达变化与听阈的变化呈现出一定程度上的相关性，这提示 cfos 蛋白样免疫反应阳性产物的表达与耳蜗的损伤修复存在一定的相关性.细胞癌 cfos
14、基因是存在于人类、豚鼠和鸟类细胞核 DNA 中的基因片段，与小鼠成骨瘤病毒中分离出的转化基因（vfos ）具有同源 DNA序列. cfos 基因编码 55 ku 的核内蛋白质，即 P55 cfos ，这一因子可识别特定的 DNA 序列来启动细胞的增殖和分化3, 在胚胎的发育过程中对细胞的生长、分化及增殖起促进作用.cfos 基因是神经细胞中最常见的快速反应基因家族中的一员，在正常情况下不易被检测，但在缺血缺氧、创伤、噪声等刺激下, cfos基因早期表达增加，并与继发性病理过程如细胞损伤修复、凋亡有关. 有研究证实, cfos 基因的高表达与神经细胞损伤后的细胞修复、凋亡存在着密切关系4-5 ，
15、其内在机制在于 cfos 基因的表达产物 cfos蛋白由胞质转入核内，与 cjun 基因的蛋白产物 cjun 蛋白形成fosjun 异源二聚体，作用于 DNA 的特殊序列，调节相关基因的转录，发挥第三信使的作用. 而不适当的过度表达产物直接或间接地激活了细胞内的限制性核酸内切酶，干预细胞核的修复功能6. cfos 在分子成熟的神经系统细胞中少有表达，在缺血缺氧、创伤、噪声等刺激下,可诱导神经细胞 cfos 的异常表达，故很多神经系统的研究已将该基因的表达情况作为受损神经细胞活性及反应性的标记物之一.cfos 癌基因蛋白产物主要位于细胞核内，故免疫组化检测表现为细胞核染色. cfos 基因的表达
16、，提示 cfos 基因参与了细胞增殖控制和信号传递. 陈向东等7研究发现，cfos 癌基因蛋白产物在内耳上皮及螺旋神经节的分化时期有表达，而在分化期以前及胚胎第 18 d 以后，其在内耳上皮、螺旋神经节细胞及其神经纤维中的表达很弱，提示cfos 基因参与了内耳的形态发育过程，在此期间可能起促分化作用. Cho 等8研究发现，过度噪声刺激后大鼠耳蜗 cfos 基因的表达增加. 本研究结果显示，cfos 癌基因蛋白产物在噪声暴露后豚鼠内耳 Corti器、螺旋神经节均有表达，且 cfos 癌基因蛋白产物的表达变化与听阈的变化呈现出一定程度上的相关性，在 cfos 癌基因蛋白产物表达较高时，ABR 反
17、应出的听阈损失较重，cfos 癌基因蛋白产物表达逐渐下降后，ABR 反应出的听阈损失亦有所恢复. 说明，cfos 基因可能参与豚鼠内耳损伤修复过程. 在此过程中 cfos 基因可能起传递损伤信息、促进核内 DNA 复制的作用，以利损伤修复的再生.自 1987 年 Cruz 等9报道发现鸟类毛细胞可以再生以来，内耳毛细胞再生的问题引起了学者的关注. Forge 等10及 Warchol 等11又发现豚鼠及人的内耳毛细胞损伤后也可以有新的再生毛细胞出现，但再生机制不明. Duckert 等12提出， 内耳毛细胞损伤后的再生修复是胚胎期毛细胞发育过程的重复， 因而从理论上讲毛细胞发育的一些因素对毛细
18、胞的再生过程也有一定作用， cfos 癌基因蛋白产物在耳蜗损伤修复中的表达变化特征， 提示 cfos 癌基因在耳蜗毛细胞毛细胞的再生过程可能起着一定作用. 对 cfos 癌基因在内耳作用的深入研究， 将有助于探明噪声损伤后耳蜗损伤修复及内耳毛细胞再生的调控机制.【参考文献】1 Nagase S, Mukaida M, Miller JM, et al. Neonatal deafening causes changes in Fos protein induced by cochlear electrical stimulationJ. J Neurocytol, 2003, 32(4):35
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