1、造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞的天然免疫黏附功能及对 NK 细胞杀伤活性的影响作者：张乃红， 冯玫， 鹿育晋 朱镭， 刘洁，高鸿鹏， 李为民， 乔振华【摘要】 本研究探讨造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞天然免疫黏附功能及红细胞对 NK 细胞杀伤活性的影响。外周血枸橼酸钠抗凝，检测红细胞在自身血浆条件下对 K562 细胞的免疫黏附并计算黏附率。用 MTT 法测定红细胞对正常 NK 细胞杀伤 K562 细胞活性的影响，并与未加红细胞时进行比较。结果表明：红细胞对 K562 细胞形成了“玫瑰花“样结合。正常人红细胞对 K562 细胞的免疫黏附结合率为（15.36.4）%，造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞对 K
2、562 细胞的免疫黏附结合率为（7.67.0）%，与正常人相比较显著下降（t=3.61, p0.001） 。不加红细胞条件下，正常人外周静脉血 NK 细胞杀伤 K562 细胞活性为 67%-71%。正常人红细胞明显增加 NK 细胞杀伤 K562 细胞活性杀伤率为（14.75.2）%，造血与淋巴组织肿瘤患者的红细胞减低 NK 细胞杀伤 K562 细胞活性，杀伤率为（4.37.6）%，二者比较有显著差异（t=6.73， p0.0001） 。结论：造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞对 K562 细胞的免疫黏附能力下降，正常人红细胞明显增加 NK 细胞杀伤 K562 细胞活性，而造血与淋巴组织肿瘤患者的红细
3、胞减低 NK 细胞杀伤 K562 细胞活性，原因需进一步研究。 【关键词】 造血组织肿瘤Erythrocyte Native Immune Adhering Function (ENIAF) in Patients with Hematopoietic and Lymphoid Neoplasms and Its Effect on NK Cell Killing ActivityAbstract The objective of this study was to investigate the change of native immune adhering function (ENIAF
4、) in selfplasma of patients with hematologic and lymphoid neoplasms and its effect on the killing activity of NK cells. The whole blood was anticoagulated with citric acid. 5 l precipitated red blood cells and 500 l plasma of patients or controls were directly mixed with 750 l quantitative K562 cell
5、s at 37 for 30 minutes. One K562 cell attached by one or more erythrocytes was counted as one rosette, the ratio of rosettes was calculated. Using K562 cells as target cells, the killing activity of NK cells isolated from normol persons was detected by MTT assay, the change of the killing activity w
6、as observed after adding RBCs. The results indicated that the ratio of rosettes formed by RBCs of 21 normal controls and K562 cells was 15.3%6.4%, and the ratio of rosetfes formed by RBCs of 24 patients and K562 cells was 7.6%7.0%. The ability of ENIAF in patients with hematologic and lymphoid neopl
7、asms was significantly lower than that in healthy individuals （t=3.61, p0.001）. The killing rate of NK cells in peripheral blood of normal individuols was 67%-71% without adding RBCs, and it increased by 14.7%5.2% after adding RBCs of normal controls but decreased by 4.3%7.6% with RBCs of patients.
8、It is concluded that the ENIAF of RBCs in patients with hematopoietic and lymphoid neoplasms decreases, accompanying the reduction of the killing activity of NK cells to K562 cells, so to detect change of ENIAF may be helpful for the assessment of the immunological function of patients with hematopo
9、ietic and lymphoid neoplasms.Key words hematopoietic neoplasm; lymphoid neoplasms; erythrocyte; innate immune adhering function; NK cell红细胞作为天然免疫的一个重要的构成部分，是机体免疫平衡和稳定的重要基础1 。红细胞能够结合、固定、聚集免疫复合物或微生物，将其呈递给吞噬细胞2，3 ，使吞噬细胞的吞噬作用增强 4-6 倍。红细胞具有免疫调节作用，能够增强 T 细胞依赖的免疫应答，调节 B 细胞的活化及 Ig 的产生，调节补体的活化过程，还能促进 NK 细胞的杀
10、伤作用。研究表明，NK 细胞直接介入控制 AML 的复发；把 NK 细胞植入 NOD/SCID小鼠排斥了植入的 AML 细胞，这也证明 NK 细胞对移植的 AML 有异体反应性。红细胞的 NK 细胞增强因子（natural killer cell enhancing factor， NKEF）是抗氧化剂家族的重要成员，它存在于红细胞质内，能够显著增强 NK 细胞对 K562 杀伤活性。造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞的天然免疫黏附功能及对 NK 细胞杀伤活性的影响王海滨等4建立了红细胞天然免疫黏附功能的快速检测方法。该方法操作简单、重复性高和稳定性好。我们应用此方法研究了造血和淋巴组织肿瘤患者红细
11、胞对 K562 细胞的天然免疫黏附功能，用MTT 法测定了造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞对正常人来源的 NK 细胞杀伤 K562 细胞活性的影响。材料和方法病例来源造血与淋巴组织肿瘤患者来源于山西省人民医院或山西医科大学第二附属医院血液科门诊及住院患者，正常对照者为门诊体检的健康人，年龄、性别构成一致，具有可比性。患者 24 例，男性 15 例，女性 9 例，年龄 19-57 岁，其中 CML 3 例，AML 10 例（M3 6 例，M4 2 例，M5 2 例），MDS 1 例，ALL 7 例，MM 2 例，NHL1 例。正常对照 21 例，男性 13例，女性 8 例，年龄 18-48 岁。患者
12、血标本采集时间为初诊或化疗 3 周以后，以避免药物对检测结果的影响。主要仪器CO2 培养箱（Heraeus and LISHEN 公司生产） ，培养瓶（50 ml） ，超净工作台，自动双重纯水蒸馏器（苏州净化设备厂生产） ，高速离心机(centrifuge 5810R 型)，水浴锅，可调微量加样器、微量滴头，普通、倒置显微镜（Olympas） ，骨髓图象分析仪(天津） ，细胞记数板，40 孔酶标板，流式细胞仪（Conlter 公司产品） ，酶标仪分光光度计（北京六一仪器产品） 。主要试剂1640 培养基购自晶美公司，10%胎牛血清，戊二醛，姬姆萨染液。淋巴细胞分离液（Ficoll 液） ，磷酸
13、缓冲液（PBS） ， MTT 粉末、DMSO 购自晶美公司。K562 细胞培养K562 细胞购自中国科学院细胞库（上海） ，放于 1640 培养液中、在 37、5% CO2 条件下培养。于倒置显微镜下观察 K562 细胞生长情况。根据细胞密度每 36-48 小时半量换液次。红细胞天然免疫黏附功能检测由肘静脉取全血 2 ml，枸橼酸钠抗凝， 1 500 rpm 离心 5 分钟。取 500 l 病人血浆和 5 l 沉淀的红细胞，直接加到 750 l 新鲜配制的定量靶细胞 K562 细胞（浓度为 105/ml）悬液中，混匀。37，水浴 30 分钟。加 1 ml 固定缓冲液(0.25 %戊二醛)，轻轻
14、混匀，5 分钟后阅片。阅片要求：取混匀液 150 l 加 50 l 姬姆萨氏染液，悬浮涂片(玻片的 2 /3)。取 4 个角和中心 5 区阅片，每区阅读 20 个靶细胞，结合上红细胞（1 个以上）的靶细胞为 1 个结合单位，计数 100 个靶细胞，计算黏附率（每例标本重复 2 次，结果取平均值）：红细胞黏附率(%) = 黏附 1 个以上红细胞的靶细胞数 / 5 区阅读的共 100 个靶细胞100%按常规方法分离效应细胞（外周血单个核细胞 PBMNC） ，流式细胞仪检测其 CD3-（CD16CD56）+ 细胞即 NK 细胞的表达（由流式细胞仪直接给出 PBMNC 中 NK 细胞的百分率） 。杀伤
15、活性测定（最佳细胞密度、效/靶比及反应时间由预实验得到）以对数生长期562 细胞为靶细胞，调整细胞密度为 4105/ ml。以外周血单个核细胞为效应细胞，用 RPMI 1640 培养液调整细胞密度为 4106/ ml，效/靶比为 101，同时设靶细胞孔、效应细胞孔和RPMI 1640 空白对照孔。上述各孔均设 3 个复孔。效应细胞、靶细胞、RPMI 1640 孔各为 50 微升/孔（反应孔） ，效应细胞孔、靶细胞对照孔各为 50 微升/孔，RPMI 1640 孔为 100 微升/孔加入 40 孔板；另设 1 孔加RPMI 1640 培养液 150 微升/孔为调零点。充分混匀， 37、5% CO
16、2 培养 4 小时 。每孔加入 20 l MTT (5 mg/ml)，继续孵育 4 小时（以上都在超净操作台操作） 。弃上清，每孔加 DMSO 150 l，充分吹打、混匀，10 分钟内用酶标仪检测 570 nm 波长 OD 值，按下述公式计算杀伤率。细胞杀伤率(%)=1 - (实验孔 OD 值- 效应细胞孔 OD 值) / 靶细胞孔 OD 值100%红细胞对 NK 细胞杀伤活性的影响红细胞的制备 健康人、造血与淋巴组织肿瘤患者的 EDTA 抗凝新鲜全血（采集 6 小时之内使用） ，经淋巴细胞分离液（Ficoll）分离得到红细胞，用生理盐水洗涤 2 次。红细胞的浓度 用 RPMI 1640 培养
17、液调整细胞密度为 4106/ ml备用。红效=11。红细胞与效应细胞一起放入靶细胞，加入后进行培养，即进行杀伤实验。以下步骤同 。统计学处理结果用 SPSS 11.0 软件进行统计后分析，行独立样本检测 （independentsample T Test） 。数据以均数标准差（SD）表示； p0.05，差异有显著性。结 果枸橼酸钠抗凝，在自身血浆条件下红细胞对 K562 细胞的免疫黏附形成了“玫瑰花“样结合（图 1、2） 。21 例正常对照外周血红细胞对 K562细胞的免疫黏附结合率为（15.36.4）%，24 例造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞对 K562 细胞的免疫黏附结合率为（7.67.0）
18、%（表 1） ，与正常人相比显著下降（t=3.61， p0.001） 。从 6 名正常对照者外周静脉血分离外周血单个核细胞，用流式细胞仪检测 PBMNC 的 CD3-（CD16CD56）+ 细胞即 NK 细胞，结果显示 NK 细胞占 PBMNC 的比例为 7%-30%（图 3） ，能够满足杀伤活性检测需要。Figure 3. Expression level of PBMNC CD3+(CD16CD56)+ cells (NK cells) detected by FCM.不加红细胞条件下，用 MTT 法测得 6 名正常人来源的 NK 细胞杀伤K562 细胞活性为 67%-71%。检测标本时每
19、次设立不加红细胞的对照，加入红细胞后测得的结果减去对照，即得到红细胞增加或减少 NK 细胞杀伤K562 细胞活性的百分率。结果表明，21 名正常对照者的红细胞明显增加NK 细胞杀伤 K562 细胞活性，杀伤率为（14.75.2）%，而 24 例造血与淋巴组织肿瘤患者的红细胞明显地减低 NK 细胞杀伤 K562 细胞活性，杀伤率为（-4.37.6）%（表 2） ，二者比较有显著差异（t=6.73， p0.0001） 。讨 论在外周血中，抗原及肿瘤细胞遇到红细胞的机会比白细胞大 1000倍，结合有抗体或补体的肿瘤细胞可通过 C3b 受体黏附到红细胞上，易被吞噬细胞捕获、吞噬1 。Craig 等2通
20、过体外用双特异性单克隆抗体反应剂连接免疫复合物到红细胞上的模型系统，揭示了免疫复合物绞链红细胞到巨噬细胞的中间转移过程。Hament 等3用流式细胞仪分析表明，在人血清存在下肺炎球菌能结合到人红细胞上，红细胞上的配体为补体受体 1（CR1） 。国内郭峰4提出了“红细胞天然免疫主干道理论“并进行了实验研究4，5 ，他们认为，各种致病性抗原进入血循环首先旁路激活血浆中的补体等可溶性免疫分子，黏附上补体 C3b 等免疫分子后绝大多数被数量巨大的红细胞补体受体免疫黏附处理，此后交给各种白细胞，激发一系列天然免疫与适应性免疫反应，最终将入侵的致病原消除。王海滨等6建立了红细胞天然免疫黏附功能（ENIAF
21、）的快速检测方法，在对 SARS 的研究中获得了许多原创性的成果。他们发现确诊为 SARS 的病人在收住院 1 周内其红细胞天然免疫黏附功能即不同程度地下降，并且随病情的加重持续降低，随病情好转开始回升，SARS 患者的红细胞 CR1 数量下降，与 ENIAF 的变化密切相关，作者认为 ENIAF 可作为临床动态观察 SARS 病情发展变化、疗效评估及预后判断的重要参考指标7 。对造血与淋巴组织肿瘤患者，我们用红白血病细胞株 K562 细胞作为靶细胞，外周血枸橼酸钠抗凝，在自身血浆中研究患者的红细胞对K562 细胞 ENIAF 的变化。结果表明，红细胞在自身血浆条件下对 K562 细胞的免疫黏
22、附形成了“玫瑰花“样结合，患者红细胞对 K562 细胞的免疫黏附结合率为（7.67.0）%，与正常人的（15.36.4）%相比显著下降（t = 3.61， p0.001） 。其他肿瘤患者红细胞的黏附功能与正常人的相比也明显低下8 。ENIAF 的变化与血沉、淋巴细胞绝对值的变化显著相关, 与合并糖尿病、慢性肝炎也有关系9 。自身免疫性肝病患者红细胞免疫黏附活性显著低于正常人群（p0.01） ，并且与自身抗体的升高、病情严重程度密切相关10 。造血与淋巴组织肿瘤患者中 ENIAF 变化的原因与意义，尚需要进一步研究。NK 细胞杀伤活性检测多用敏感细胞株如 K562 细胞，方法有 MTT 比色法、
23、LDH 释放法、3HTdR 参入法等。崔晓明等11研究结果表明，K562 细胞数在（1-4）104/孔时线性关系较好，效、靶作用的时间定为2 小时，加 MTT 后再作用 4 小时，效、靶比选择 51、101 结果较理想。王琦等12对 MTT 比色法进行了改良，同时证明 MTT 比色法与 3HTdR掺入法有高度的相关性（r = 0.96， p0.01） 。我们采用 MTT 法测定 NK 细胞杀伤 K562 细胞的活性，发现不加红细胞条件下，杀伤活性为 67%-71%，与上面的结果一致。正常人红细胞能使 NK 细胞杀伤 K562 细胞活性的百分率明显增加（14.75.2）%，造血与淋巴组织肿瘤患者
24、的红细胞却使 NK 细胞杀伤 K562 细胞活性明显降低（4.37.6 ）%，其原因需要进一步研究。对破坏的红细胞刘希英等13作了探讨，他们制备红细胞胞质液，观察红细胞胞质液对 NK 细胞杀伤活性的影响。发现恶性肿瘤病人 NK 细胞活性明显低于正常对照组（F= 12.85， q = 7.86， p0.01） ；正常人红细胞胞质液可以显著提高自身及病人 NK 细胞活性（F= 4.32-5.89， q = 3.96-4.49， p0.05、0.01） 。在造血系统，许多证据提示 NK 细胞参与抗白血病免疫反应14 ，NK 细胞数量或活性与急性白血病的预后之间存在负相关，NK 细胞活性依赖性的免疫缺
25、陷综合征与淋巴、造血系统肿瘤发生率升高有关，NK 细胞在异基因骨髓移植中的 GVL 效应中起重要作用。Miller 等15对 NK 细胞治疗抗白血病的作用进行了研究，结果显示在较强的免疫抑制方案（HiCy/Flu ）后输注 NK 细胞造成了内源性 IL15 的明显上升及供体NK 细胞的扩增，并且在 19 例预后不佳的 AML 患者中 5 例产生了完全血液学缓解。所以，红细胞可能影响 NK 细胞杀伤肿瘤细胞的活性。进一步研究造血与淋巴组织肿瘤患者红细胞免疫与 NK 细胞免疫、DC 功能、T、B 细胞免疫等之间的关系，对于揭示其发病机制、发展更全面的治疗策略可能具有重要的意义。【参考文献】1 郭峰，钱宝华，张乐之主编. 现代红细胞免疫学. 上海：上海第二军医大学出版社. 2002：402Craig ML, Bankovich AJ, Taylor RP. Visualization of the transfer reaction: tracking immune complexes from erythrocyte
