1、噪声所致耳蜗毛细胞表达中维生素的调节【摘要】 目的 探讨维生素 E 在噪声暴露引起的大白鼠听力损伤有明显的保护作用及机制。方法 健康雄性纯种 Wistar 大鼠 9 只，鼠龄 23个月，体质量 180200 g,由长春市高新开发区实验动物中心提供（清洁级） 。无噪声暴露及耳毒性药物使用史，耳廓反射正常，实验前清洁外耳道，显微镜下检查均无中耳炎。以听阈、耳蜗基底膜铺片及免疫荧光染色为指标，观察大白鼠在稳态噪声持续暴露之前 30 d 至暴露后 7 d，灌维生素 E 及生理盐水，对大白鼠听觉脑干电位分析和耳蜗外毛细胞（OHC）丢失率分析及 NF-B 在耳蜗毛细胞中表达定量分析。结果 维生素 E 在噪
2、声暴露后大白鼠听力阈值明显低于单纯噪声组，OHC 丢失率也明显降低，免疫荧光染色结果显示 VE 干预组的耳蜗细胞表达 NF-B 的强度低于单纯噪声组（P005） 。结论 维生素 E 在噪声暴露引起的大白鼠听力损伤有明显的保护作用，通过上调耳蜗毛细胞中 NF-B 的表达。 【关键词】噪声； 耳蜗; 毛细胞；维生素 E；NF-B 【Abstract】 Objective To discuss the protection and mechannism ofvitamin Ein the rats hearing impairment induced by noise exposure.Method
3、s Take the audibility thresholdbasilar membrane stretched preparation and immunofluorescence stain as the index, observing that the rats were put in the stationary noise before 30 days until after that for 7 days, have vitamin E and sodium chloride , check the auditory brain stem potential and the l
4、ost rate and NF-B of the OHC in the cochlea hair cells expression quantitative analysis. Result After the noise exposure, the rats which have vitamin E have significant lower auditory acuity threshold than the purely noise exposure,and much lower lost rate of OHC. Lmmunofluorescence stain demonstrat
5、e that the group have vitamin Ehave lower intensity of NF-B expression in the cochlea hair cells,(P005).Conclusion vitamin E has obvious protection in the hearing impairment of rats ,working out by upregulation of NF-B expression in the cochlea hair cells. 【Key words】Noise; Cochlea; Hair cell vitami
6、n E; NF-B 噪声可产生可恢复的暂时性阈移（TTS）或不可恢复的永久性阈移（PTS） ，甚至造成噪声性耳聋。对噪声性听力损伤机制迄今尚无明确报道。本实验在大白鼠噪声暴露前 30 天至暴露后 7 d 灌胃维生素 E，对其防止 TTS 转变为 PTS 及促进听力恢复有无保护作用进行探讨。分析维生素 E 干预噪声听觉损伤与耳蜗毛细胞中 NF-B 的表达的关系，确定 VE减少噪声引起的毛细胞死亡的分子机制。 1 材料与方法 11 动物分组与处理 选择鼓膜听觉脑干电位仪测 4000 Hz 频率双耳听阈在 2328 dB 的健康雄性大白鼠 30 只，体质量 180200 g；随机分为 3 组；正常组
7、 12 只（24 耳）维生素 E 组 12 只（24 耳） ，单纯暴露组12 只（24 耳） 。维生素 E 组在暴露前 30 d 至暴露后 7 d 连续灌胃4 mg/（kgd） 。单纯暴露组在暴露前 30 d 至暴露后 7 d 连续灌胃 09生理盐水5 ml/（kgd） 。 噪声暴露：连续用药 30 天后即行噪音暴露，将动物置于小笼内(40 cm30 cm30 cm )每笼 2 只，放入暴露舱（05 m15 m05 m）用 UZ-3 型噪声发生器发生， A-K200 功率放大器放大，有位于暴露舱四周的扬声器向暴露舱播放。暴露时用声压计进行连续监测，噪音保持在频率为 4000 Hz，平均声强为1
8、16 dB SPL（sound pressure level） 。动物暴露范围内声扬不均匀度为2 dB。持续暴露 6 h。 12 听阈测试 测试在隔音屏蔽室内进行，10水合氯醛（330 mg/kg）腹腔注射，麻醉生效后安插针式电极，记录电极的安装用不锈钢针刺入前颅顶正中穿透皮肤至颅骨骨膜，置于冠状缝中点处，同时给声耳及对侧耳后皮下分别刺入不锈钢针，作为参考电极和接地电极。TDH-39 型耳机给声，声源距耳廓 1 cm，诱发电位用信号处理机叠加处理，进行测试：刺激声为交替短声（clicks） ，重复率 10 次/s。实验选用主要参数为：带道滤波为 323 KHz，扫描时间为 10 ms，叠加为
9、512 次。测试声强由 110 dB SPL 开始，接近阈值后按 5 dBSPL 渐档递减，电生理反射由针式电极引出，经放大及处理后以波形的方式显示于荧光屏，阈值是以肉眼刚能辨认的脑干电位波群中以波的声强表示。 13 耳蜗基底膜铺片 三组动物完成最后一次听阈测试后(噪声暴露停止后第 7 天)处死动物立即取出颞骨,打开听泡,4%甲醛固定 24 h,10%EDTA 脱钙 1 周,分离出基底膜, 三组动物随机抽出各 6 只(12 耳),在常规苏木素染色,在放大 400 倍的光学显微镜下，以目镜中 024 mm显微测微尺为测量尺度，逐个视野从蜗底向蜗顶进行 OHC 记数。以 OHC境界模糊或消失、细胞
10、碎裂或缺失为 OHC 死亡标志。钩部和蜗尖各有 4个视野不做记数。所得数据分析 OHC 损失分布情况。 14 免疫荧光染色 三组动物基底膜各 6 只(12 耳)，用 01 mol/L PBS 洗涤 3 次，每次 5 min，加入 01% Triton X-100 处理 15 min，5%羊血清封闭 1 h，加入一抗（NF-B 工作浓度 1：100） ，室温孵育 1 h，用 01 mol/L PBS 洗涤 3 次，每次 15 min，加入，Alexa Fluor555 Goat anti-rabbitIgG（工作浓度 1：400） ，室温、避光放置 1 h，01 mol/L PBS 洗涤 3 次
11、，每次 15 min，轻轻摇动。弃掉洗涤液，最后样品均再用 1 g/ml 的 Hoechst 33342 室温染色 5 min，甘油封片。用Fluoview FV 1000 激光扫描共聚焦显微镜观察（PMT 电压值为 650，CA针孔值为 160） 。NF-B 阳性表达为红色荧光，细胞核为蓝色荧光。阴性对照实验中，用 PBS 代替第一抗体，排除非特异性的二抗结合。15 统计学方法 采用 Fluoview FV 1000 激光共聚焦显微镜分析软件分析基因表达相对荧光强度，使用 Sigma Stat203（sigma）统计软件，采用 one way ANOVA 检验，P005 认为有统计学差异。
12、2 结果 21 ABR 阈值 暴露组在噪声暴露前和噪声暴露结束后不同时间的听阈阈值见表;结果表明,单纯暴露组和补 VE、均有明显听力损失,表现为听阈上移（P001）,按完全随机设计多个样本均数比较的方差分析表明,噪声暴露结束后 1 h，1，2,3,7 d, 单纯暴露组和补 VE、相比，除噪声暴露后 1 h 相差不显著外（P005） ，均有非常显著的差异（P005）,表 1-1 为两组动物在噪音暴露后阈值的恢复曲线示意图,可见噪声暴露后 1 h 差异不显著，外补 VE 组 ABR 阈值恢复明显高于单纯暴露组。见表 1，图 1。 22 耳蜗基底膜铺片毛细胞变化 耳蜗基底膜铺片苏木素胞核染色显色结果
13、：正常组耳蜗 HC 形态正常，其 3 排 OHC 和内毛细胞（IHC）排列整齐，结构清晰，无缺失。补 VE 在噪声暴露第 7 天 OHC 有散在缺失，且以第三排为主，单纯暴露组出现细胞境界模糊或消失，且在 3 排 OHC中以第三排 OHC 损伤为重，缺失明显，第二排、第一排均有不同程度的缺失，IHC 也有丢失。对耳蜗基底膜铺片进行全长 OHC 记数，绘制耳蜗图，观察其 OHC 损失分布情况，补 VE 组 OHC 缺失率明显底于单纯暴露组（P005） 。见图 2-1、2-2。 23 耳蜗毛细胞 NF-B 的表达 单纯噪声组以及 VE 干预组在暴露后 7 d 处死动物，分离耳蜗基底膜，进行 NF-
14、B 表达定量分析。结果见表 3-1，图 3-2。VE 干预组的耳蜗毛细胞表达 NF-B 的强度低于单纯噪声组。 3 讨论 噪音对听觉的损伤是一个复杂的多因素的机制，各种因素又相互关联，相互影响。目前倾向于将噪声对听觉的损伤归纳为机械性、血管性和代谢性三个方面。超高强度 130 dB NHL 以上的噪声对 HC 的损伤主要以机械损伤为主，中高强度 110-130 dB NHL 噪声暴露以血管性和代谢性损伤为主。已经证实，强噪声刺激作用下耳蜗血管可发生一系列改变：血管痉挛收缩或扩张，血流速度变慢，局部血液灌注量减少；内皮细胞肿胀、通透性增加，血液浓缩粘滞度显著增高，血小板和红细胞聚集、血栓形成1-
15、5；这些变化导致微循环障碍，耳蜗血流下降,内耳供血不足,内外淋巴液氧张力下降6，7。血管改变引起的局部缺血缺氧，造成了耳蜗内环境的代谢紊乱，HC 代谢障碍，酶系统的功能障碍，从而细胞出现包括 Corti 器形态结构的损伤和声电转换的功能障碍等一系列病理生理改变。最近研究表明8，噪声引起代谢性损伤首先对两个结构产生破坏，一是可影响静纤毛结构，从而造成耳蜗微机械结构的改变，二是使 IHC 过量释放神经介质，从而影响神经传导。有研究表明，噪声暴露可破坏耳蜗的抗氧化体系，导致氧化和抗氧化失衡，从而在耳蜗产生大量活性氧自由基。过量的氧自由基可以攻击生物膜，使膜发生脂质过氧化（LPO） ，诱发 LPO 的
16、大量产生，影响细胞内的重要生化反应，对耳蜗组织产生损伤。VE 通过自身被氧化成生育醌，从而将 ROO-转变为化学性质不活泼的 ROOH，中断脂类过氧化的连锁反应，有效抑制脂类过氧化作用，保护细胞免受不饱和脂肪酸氧化产生的毒性物质的伤害，在防止衰老，抗肿瘤等方面起着重要的作用。VE 本身具有产生酚氧基的结构，产生的酚氧基能够猝灭并能同单线态氧反应，保护不饱和脂肪酸免受单线态氧损伤。还可以被阴离子自由基和羟自由基氧化，使不饱和脂肪酸免受自由基攻击，从而抑制脂肪酸的自动氧化。VE 不仅对生物膜的结构和功能有较好的保护作用9，还能迅速捕捉自由基，生成的生育酚自由基又可进一步与另一个分子自由基反应生成非
17、自由基生育醌，故抗氧化能力较强10。 NF-B 是一类具有多向转录调节作用的核蛋白因子，存在于多种组织的多种细胞中，具有广泛的生物学活性激活后参与许多基因的转录调控，在感染、炎症反应、氧化应激、细胞增生等过程中发挥作用。近年的研究表明 NF-B 与细胞凋亡的关系密切，其参与多种凋亡相关基因的转录调控在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。多种细胞外刺激信号可激活 NF-b，如细胞因子 IL-1 TNF-a 及活性氧自由基等11，12席恺等13采用豚鼠耳蜗缺血-再灌注损伤模型，观察耳蜗组织形态功能变化与 NF-B、TNF- 表达的关系。结果发现，缺血组及缺血再灌注各组的NF-B 在耳蜗各转 SV，I
18、HC，OHC 和 SGC 各部位表达随时间延长逐渐增强，再灌注 24 h 组达高峰。而 TNF-a 表达水平与 NF-B 表达一致。认为耳蜗缺血过程中大量产生的活性氧刺激，NF-B 被激活，诱导 TNF- 分泌增加，而缺血再灌注各组 TNF- 水平加强，反过来会进一步激活 NF-B，形成恶性循环，加重缺血损伤的程度。Fujioka 等14采用 RT-PCR方法分析噪声暴露后大鼠耳蜗组织细胞因子表达变化，发现噪声暴露后早期 TNF-a、IL-1a 和 IL-6 表达急剧增加。笔者的实验结果显示，噪声暴露后 7 d 的耳蜗毛细胞中表达 NF-B 的荧光强度明显强于正常耳蜗。笔者推测噪声引起 TNF
19、-a 增高，TNF-a 与其特异性跨膜受体 TNFR 结合后，在胞质中形成肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域（TRADD）受体，作用蛋白（RIP）肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF2）的复合物，诱导 NIK 表达，作用于 IB 同时激酶 IKK。在蛋白酶的作用下，磷酸化的 IB 从p50/p65 异源二聚体上降解进而 p50/p65 异源二聚体活化进入胞核中发挥转录活性，促进凋亡相关基因的表达，诱导细胞凋亡。笔者发现 NF-B高峰表达时期，毛细胞形态学主要特征是核肿胀，而且有文献证实，此刻发生的细胞学改变，部分可逆，基于 NF-B 与细胞死亡存在双向调节关系: 既可抑制细胞死亡也可促进细胞死亡，笔
20、者推测早期的 NF-B 增高可能具有抑制细胞死亡作用，而耳蜗组织中持续高表达 NF-B 则是促进细胞凋亡。Carcamo 等15的研究发现，VE 能够抑制培养的人类多种组织来源的细胞系 NF-B 活性，通过抑制 TNF 诱导的 NIK 激活和 IKK 激酶活性。在本实验中发现，VC 和 GSH 干预组耳蜗表达 NF-B 水平与单纯噪声组没有明显差别，而 VE 干预组的 NF-B 表达水平与单纯噪声组相比明显降低。提示不同的刺激信号对 NF-B 激活和信号通路不同，也可能 VC 和 GSH 介导噪声保护的途径与 VE 不同。Chen 等16在实验中见到增加细胞外谷胱甘肽水平时，能增加对 TNF
21、诱导 NF-B 活化和对凋亡的耐受。Carlson 等17应用维生素治疗脓毒血症，发现 VE 能够通过降低NF-B 活性，抑制线粒体细胞色素 C 释放，接触细胞因子释放，改善心肌收缩功能。Calfee-Mason 等18研究发现饮食补充 VE 能够抑制镇静安眠剂诱导的 NF-B 激活。 参考文献 1 Nakashima T,Naganawa S,Sone M,et al.Disorders of cochlear blood floew.Brain Res Brain Res Rev,2003,43(1):17-28. 2 Lamm K,Lamm C,Arnold W.Effect of is
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