1、增生性玻璃体视网膜病变组织中的 T 淋巴细胞与 HLADR 抗原作者：张文霁，韩泉洪，惠延年，马吉献 【关键词】 玻璃体视网膜病 关键词: 玻璃体视网膜病，增生性;T 淋巴细胞;HLA-DR 抗原;免疫组化染色 摘 要:目的 研究免疫介导过程在增生性玻璃体视网膜病变（PVR）发生中的作用. 方法 应用特异性单克隆抗体和免疫组织化学染色的方法对视网膜玻璃体手术取材标本，包括 PVR B级玻璃体手术集取物以及PVR C，D 级增生膜进行观察，检测其中 CD3 ，CD4 ，CD8 和 HLA-DR的表达情况. 结果 7例 PVR B级的标本中，6 例（85.7%）有 CD3 阳性表达细胞，其中 2例
2、（28.5%）同时有 CD4 阳性细胞，未发现 CD8 阳性细胞，2 例（28.5%）有 HLA-DR阳性表达细胞存在.14 例 PVR C级以上的增生膜标本中，CD3 均为阳性表达，10 例（71.4%）有 CD4 阳性表达细胞，5例（35.7%）有 CD8 阳性表达，9 例（64.3%）有 HLA-DR阳性表达. 结论 PVR病变组织及增生膜有 T淋巴细胞的存在，提示有 T细胞参与 PVR的病变过程，及自身免疫反应的可能. Keywords:vitreoretinopathy，proliferative;T-lymphocytes;HLA-DR antigens;immunohistoch
3、emical stain-ings Abstract:AIM To investigate inflammatory and immune-mediated processes contributing to the pathogenesis of prolif-erative vitreoretinopathy（PVR）.METHODS Specimens were obtained during vitrectomy，including fluid collections of PVR grade B，and peri-retinal membranes from PVR grade C
4、or D.Immunohistochemical staining was performed to examine the presence of CD3 ，CD4 ，or CD8 markers and（human leukoiyte antigen，HLA）HLA-DR positive cells in these specimens.RESULTS CD3 positive cells were found in6of7specimens of PVR B grade，and CD4 positive cells were present in2of the6CD3 positive
5、 specimens.CD8 markers ex-pression was negative in all7specimens.Positive staining for HLA-DR was found in2specimens.In14PVR C，D mem-branes，lymphocytes expressing CD3 markers were observed in all，whilst T lymphocytes expressing CD4 and CD8 markers were found in10and5of14membranes，respectively.Posi-t
6、ive staining for HLA-DR was found in9of14membranes.CONCLUSION Findings indicate that T lymphocytes are present in PVR membranes and may be activated.These cells may play a potential role in the development of PVR. 0 引言 增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreo-retinopathy，PVR）是裂孔源性视网膜脱离手术失败的主要原因.PVR 属于眼内发生的过
7、度损伤修复过程，经历炎症期、增生期和瘢痕期三个阶段，是一个以巨噬细胞和淋巴细胞等炎症细胞浸润为主的慢性炎症反应1，2 .巨噬细胞诱发的 PVR模型对巨噬细胞在 PVR中的作用进行了较好阐明3 ，但 Gabrilian K等证实了在 PVR的病理过程中其它类型白细胞有不可替代的作用4 .本实验利用免疫组化技术，观察不同时期 PVR病变组织中 T细胞表面标记物 CD3 ，CD4 ，CD8 以及人白细胞抗原 HLA-DR的表达情况，以进一步探讨 PVR的发病机制. 1 材料和方法 1.1 材料 标本来源于 1997-09/2000-03在西京医院眼科住院的孔源性视网膜脱离伴 PVR患者 21名.患者
8、无先前存在的眼内炎症性疾病.PVR 分级标准参照 1983年美国视网膜学会分级方法.其中 7例 PVR B级取玻璃体切割液集取物，离心沉淀后取沉淀物;14 例 PVR C级以上患眼行玻璃体切割术时取视网膜表面增生膜标本，其中下膜 5例，前膜 9例.以上组织用40gL-1 多聚甲醛固定 30min，4.经脱水、透明和浸蜡，制成蜡块.最后制成 5m 厚的切片，贴附于载玻片上. 1.2 方法 抗体和试剂:小鼠抗人 CD3 ，CD4 ，CD8 和 HLA-DR单克隆抗体，ABC免疫组化试剂盒均购自中国博士德公司;免疫组织化学染色:切片浸入 7.5mLL-1 H2 O2 -PBS，3730min，以阻断
9、内源性过氧化物酶.羊血清（1200）封闭消除非特异性染色.滴加小鼠特异性抗体 CD3 （1100） ，CD4 （1200）CD8 （1100） ，HLA-DR（1100）.湿盒，37孵育 30min.PBS振洗 3次，滴加生物素化羊抗小鼠 IgG（1200） ，湿盒，37孵育 30min.滴加 ABC复合剂，37孵育 30min.DAB显色，镜下观察，水洗中止反应，苏木精复染核，脱水透明封片. 采用扁桃体切除术后的新鲜人扁桃体组织作为阳性对照;采用人角膜移植后供体眼的眼后段组织，包括视网膜色素上皮（RPE）细胞、视网膜组织、脉络膜和巩膜，以及不加一抗的标本作为阴性对照，与手术取材标本平行染色.
10、以背景清晰、棕黄色部位定位明确的细胞作为阳性细胞. 2 结果 阳性对照组显示所用的所有单克隆抗体均呈阳性反应，阳性细胞胞质中呈现棕色或深棕色的颗粒，细胞核经复染成蓝色.阴性对照组中未见阳性染色.在 7例 PVR B级组织中，6 例（85.7%）有 CD3+ 细胞，阳性表达的细胞散在分布，呈典型的淋巴细胞形态（Fig1）;其中 2例（28.5%）有 CD4 和 CD3 同时阳性表达细胞;在 7例中 CD8 均为阴性表达;2例中存在 HLA-DR+ 细胞（Fig2） ，其中 1例同时有 CD3+ 细胞，另 1例同时有 CD3 和 CD4 阳性表达，HLA-DR 表达阳性的细胞呈卵圆形，细胞核较圆，
11、并可见少量的色素. 在 14例 PVR C级以上的增生膜标本中，14 例均为 CD3+ 表达，阳性染色的 T淋巴细胞存在于组织基质中，呈典型的淋巴细胞形态（Fig3）;CD4+ 细胞存在于 10例中（71.4%） ，其中 4例同时有 CD8 阳性表达，8例同时有 HLA-DR阳性表达，HLA-DR+ 细胞在增生膜的表面呈稀疏分布，细胞多为长梭型，细胞核为卵圆形（Fig4）;在 CD4 阴性表达的 4例中，1例同时有 CD8 阳性表达，1 例同时有 HLA-DR阳性表达. 3 讨论 本实验中，我们观察不同时期 PVR病变组织中，T 细胞和 HLA-DR阳性细胞的存在情况.结果显示，在大部分 PV
12、R病变组织中存在着 CD3+ T细胞，CD4+ 细胞在较多的标本中存在，CD 8+ 细胞只是在少数标本中存在.但所有阳性细胞在片中所占比例都较低，约 1%.HLA-DR+ 细胞在 PVR B级组织中较少，在增生膜组织中数量增多. 有实验5 表明，T 淋巴细胞在纤维化和伤口愈合中有重要作用.激活的 T细胞调节纤维化反应可通过直接分泌细胞因子如 TGF- 和 TNF- 或启动巨噬细胞源性细胞因子的释放6，7 .成纤维细胞能产生可溶性因子，延长 T细胞的存活并增强 T细胞对 IL-2的反应 8 ，这一机制可能延长活跃的 T细胞在炎症和纤维化部位的逗留. 主要组织相容性复合体（MHC）类抗原（HLA-
13、DR）通常由抗原提呈细胞（APC）表达，从而能够提呈抗原给 CD4+ T淋巴细胞，使其激活.有研究9，10 表明，RPE 和神经胶质细胞在炎性细胞（巨噬细胞、淋巴细胞）分泌的细胞因子如 INF- 的刺激下，可异常表达 MHC分子，而具有提呈抗原的功能，可作为 APC提呈自身及外来抗原，激活 CD4+ T细胞介导的免疫反应.并且，用 S-抗原免疫后的鼠 RPE细胞与 T细胞共同培养，RPE 细胞可处理和提呈 S-抗原，引起抗原特异性的 CD4+ T细胞激活9 .这些都暗示着 PVR发生中 HLA-DR+ 细胞可能充当 APC的作用11 ，在玻璃体视网膜的微环境中激发 CD4+ T淋巴细胞介导的局
14、部自身免疫反应.本实验结果提示 CD8+ T细胞数量较少. HLA-DR 表达阳性与 PVR病理机制之间的关系尚不明确.可能是有缺陷的免疫应答基因编码在 HLA-DR位点的邻近区域，导致免疫调节异常，表现为自身免疫.在本实验中 HLA-DR在增生膜中有较多的表达，提示 PVR的病变过程与自身免疫反应有一定的关系.但是这种反应具体针对哪一种自身抗体发生，尚需要进一步研究. 在 PVR B级标本中，活化 T细胞和 HLA-DR+ 细胞较少，而在增生膜中二者均增多，提示 T细胞的活化以及诱导增生膜组织细胞 HLA-DR的表达多发生在 PVR形成的后期阶段，T 细胞在视网膜脱离后，通过被破坏的血-眼屏
15、障进入玻璃体腔，而 T细胞的激活可能是与 RPE或胶质细胞共同滞留在视网 膜表面时才开始的.虽然在本实验中，T 细胞在 PVR病变组织中存在数量较少，但这些少量的 T淋巴细胞已可分泌足够局部浓度的细胞因子，以及引发增生膜的 RPE细胞表达 HLA-DR分子. 我们的研究结果表明 T细胞参与 PVR的病变过程，及自身免疫反应的可能.利用 T细胞特异性作用药物如环胞霉素 A已用于治疗眼内某些炎症.相似的特异性治疗措施将有助于 PVR的预防和治疗，从而提高视网膜脱离手术的成功率. 参考文献: 1Kirchhof B，Sorgente N.Pathogenesis of proliferative v
16、itreo-retinopathy J.Dev Ophthalmol，1989;16（1）:1-53. 2Weller M，Wiedemann P，Heimann K.Prolifertive vitreo-retinopathy is it anything more than wound healing at the wrong place?J.Int Ophthalmol，1990;14（2）:105-117. 3Hui YN，Goodnight R，Sorgente N，Ryan SY.Fibrovascular proliferation and retinal detachment
17、 after intravitreal injection of activated macrophages in the rabbit eye J.Am J Ophthalmol，1989;108（2）:176-184. 4Gabrielian K，Wang HW，Lee M， Ogden TE，Ryan SJ.Effect of leukopenia on experimental post-traumatic retinal detachment J.Curr Eye Res，1994;13（1）:1-9. 5Scott S，Pandolfi F，Kurinick JT.Fibrobla
18、sts mediate T cell survival:A proposed mechanism for retention of primed T cells J.J Exp Med，1990;172（6）:1873-1876. 6Charteris DG，Hiscott P，Grierson I，Lightman SL.Prolifera-tive vitreoretinopathy:Lymphocytes in epiretinal membranes J.Ophthalmology，1992;99（9）:1364-1367. 7Charteris DG，Hiscott P，Robey
19、HL，Gregor ZJ，Lightman SL，Grierson I.Inflammatory cells in proliferative vitreoretinopathy subretinal membranes J.Ophthalmology，1993;100（1）:43-46. 8Barbul A.Role of T cell-dependent immune system in wound healing J.Prog Clin Biol Res，1988;266:161-175. 9Percopo CM，Hooks JJ，Shinohara T，Caspi R，Detrick
20、B.Cy-tokine-mediated activation of a neuronal retinal resident cell pro-vokes antigen presentation J.J Immunol，1990;145（12）:4101-4107. 10Osusky R， Dorio RJ，Arora YK，Ryan SJ，Walker SM.MHC classpositive retinal pigment epithelial（RPE）cells can func-tion as antigen-presenting cells for microbial superantigen J.Ocul Immunol Inflamm，1997;5（1）:43-50. 11Xun WR，Yang CZ，Wang SM.Yan Mianyi Bingli（Ophthalmo-logical Immunopathology） M.Beijing:Renmin Weisheng Chubanshe（Peoples Medical Publishing House） ，1997:34-54.
