1、正交实验法优选熟地黄中 5 HMF 的提取工艺【摘要】 目的： 以 5 羟甲基糠醛(5HMF) 含量和熟地黄干膏收得率为指标，探讨熟地黄中 5HMF 的提取工艺. 方法：采用正交试验法考察加水量、提取时间、提取次数及醇沉浓度 4 个因素对 5HMF 含量和干膏收得率的影响，并运用高效液相法测定 5HMF 的含量. 结果： 通过对正交试验结果的极差分析，得出提取次数和提取时间两个因素对干膏收得率和含量影响最大，参考两种主要影响因素，最终确定 8 倍量水、提取 3 次、每次 1.5 h, 700 mL/L 乙醇沉淀的提取工艺，并对该工艺进行三次重复性小试实验. 5HMF 收得率可达 58%以上.
2、结论： 通过对上述提取条件的重复性考察，该方法重复性好，5HMF 收得率稳定，为进一步中试实验提供了参考依据. 【关键词】 熟地黄；5 羟基糠醛；中药制药工艺【Abstract】 AIM: To optimize the water extracting technology condition of 5HMF from Rehmannia glutinosa libosch. METHODS: The extraction procedure of Rehmannia glutinosa libosch was studied by orthogonal design with dry ex
3、tract yield and 5hydroxymethyl2furfura(5HMF)as the detective indices. Effects of four factors (the amout of water, extracting time, the mumber of times and alcohol concentration)and 3 levels for each factor on extraction rate were analyzed. RESULTS: The 5HMF extraction rate reached over 58% under th
4、e optimum extraction condition which was the adding 8 folds of water, and decocting for 3 times,1.5 h once and the precipitation with 700 mL/L alcohol. CONCLUSION: The optimum waterdecocting condition is repeatable, and ensure stable 5HMF extraction rate. It could be used in the future middlescaled
5、preparation of Rehmannia glutinosa libosch.【Keywords】 radix rehmanniae praeparata; 5hydroxymethyl2furfura(5HMF); pharmaceutical technology0 引言熟地黄为玄参科多年生草本植物地黄（Rehmannia gLutinosa Libosch ）的根，经加工炮制而成，在临床上应用较为广泛. 熟地黄含有梓醇、糖类、甙类和 5 羟甲基糠醛(5hydroxymethyl 2furfura, 5HMF) 等多种化学成分. 有研究报道生地黄炮制成熟地黄后 5HMF 的含量增加
6、 20 倍左右1 ，在对 5HMF 药理作用的研究中发现其具有抗氧化、改善血液流变学等多种对人体有利的作用2-3. 然而关于对熟地黄中 5HMF 的提取工艺却少见文献报道，为了更好的发挥熟地黄的药用价值，我们运用正交设计法，考察影响其提取的因素，筛选 5HMF 的最佳提取工艺条件.1 材料和方法1.1 材料美国产 Beckman 125 型高效液相色谱仪（32Karat TM Software 色谱工作站） ，色谱柱为 DiamonsiL C18(5 L 2004.6 mm ).BT 125D 型电子天平（北京 Sartorius 公司） ；DL720 型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司
7、） ；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，5HMF 对照品(批号：111626200503, 中国药品生物制品检定所)，水（重蒸水） ，熟地黄药材(陕西省药材总公司).1.2 方法1.2.1 提取工艺设计1.2.1.1 药材吸水率考察精密称取熟地黄 3 份，每份 20 g. 分别加 10 倍量水浸泡，每 30 min 观察 1 次药材的浸透情况，直至药材掰开无硬心为止，并记录浸泡时间，用量筒测量剩余水量，计算吸水率（表1）.1.2.1.2 正交实验设计选用 L9（34）正交进行实验，以熟地黄浸膏得率，5HMF 含量作为考察指标，因素水平安排见表 2. 称取熟地黄粗粉 9 份，每份 20 g，按正
8、交实验设计方案条件提取过滤，合并滤液，定容到 50 mL，备用. 表 1 熟地黄吸水率的考察表表 2 因素水平表1.2.25HMF 的含量测定1.2.2.1 溶液制备精密称取 5HMF 对照品适量，置于 5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀制成含 7.9 mg/L 的溶液，作为对照品溶液. 精密称取药材提取液 0.5 mL，蒸干溶剂，残渣用甲醇定容于 5 mL 容量瓶中，用 0.45 m 微孔滤膜滤过，作为供试液.1.2.2.2 色谱条件的选择色谱柱： DiamonsiL C18(5 L 2004.6 mm )；流动相为乙腈水 (1585)，流速 1 mL /min，柱温25. 测
9、定波长 280 nm. 进样量 20 L. 在上述条件下，样品 HPLC 色谱图中 5 羟基糠醛与其他峰分离良好.1.2.2.3 线性关系的考察精密量取对照品溶液适量，置 50 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，分别吸取对照溶液 4, 8, 12, 16 和 20 L 注入液相色谱仪中，测定其峰面积，以峰面积为纵坐标(A)，对照品的浓度为横坐标(C)，绘制标准曲线，得回归方程：Y=132034X+284737, R=0.9996，5HMF 在 2.27.9 mg/L 范围内呈良好的线性关系.1.2.2.4 精密度试验精密吸取 10 L 对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样 6 次，测得 5HMF
10、平均峰面积，计算相对标准差RSD=1.62%.1.2.2.5 稳定性试验在相同条件下，精密吸取供试品溶液，在 12 h 内，每隔 2 h 测定 1 次峰面积，计算 RSD 为 1.78% ，表明本品在 12 h内稳定.1.2.2.6 加样回收率试验抽取 4 号样品加入 5HMF 对照品适量，混匀，按供试品溶液制备，并按上述色谱条件测试. 按供试品溶液制备方法提取测定，测得峰面积并计算含量，平均回收率100.58，RSD=2.72%.1.2.3 重复性小试实验验为进一步考察上述提取工艺的稳定性，按1.2.2.1 的实验条件进行 3 次重复性小试实验.2 结果通过正交试验极差分析结果显示各因素对出
11、膏率的影响依次为提取次数提取时间醇沉浓度加水量（表 3）. 对含量的影响依次为提取时间提取次数醇沉浓度加水量，通过极差分析表明，提取次数、提取时间对 5HMF 的含量和熟地黄浸膏得率的影响比较著性，溶媒用量、提取时间影响较小. 综合分析两种指标，初步确定熟地黄提取的最佳工艺应用 8 倍量的水，每次提取 1.5 h,提取 2 次，然后用 950 mL/L 乙醇沉淀至 700 mL/L. 按上述优化条件进行重复 3 次实验（表 4） ，5 羟基糠醛收得率可达 58%以上. 表 3 正交实验极差分析表表4 熟地黄优选提取工艺的重复性小试实验3 讨论熟地黄药材为炮制品，水提后存在出膏过多等问题，该工艺
12、中引入醇沉净化方式进行处理，在保证含量的前提下，控制出膏率，可为制剂提供方便. 我们用正交设计法对 5HMF 的提取工艺进行优选，通过直观、极差分析法选出最佳工艺，为验证此优选方案的可行性，我们又按最佳工艺进行了 3 次重复性小试验，结果稳定，5HMF 收得率可达58%以上，初步完成了对熟地黄药材的实验室及小试实验提取工艺的筛选.对于熟地黄中 5HMF 含量的测定有薄层扫描、高效液相等多种方法4-5. 结合实验室现有条件，我们选取高效液相法进行测定. 张清波等6和秦向阳等7曾报道 HPLC 测定熟地黄中 5HMF 的含量，但我们在其给定的流动相和检测波长下 ，以 DiamonsiL C18 分
13、析柱为色谱柱进行实验，发现 5HMF 的色谱峰出现拖尾和分叉现象 ，且流动相极性太大，出峰时间较短，溶剂峰干扰严重. 为此，我们对实验条件进行改进采用 DiamonsiL C18 ( 5 L 2004.6mm )色谱住；以乙腈水 (1585)为流动相，流速 1 mL/min，柱温 25. 测定波长 280 nm，取得了较好的分离效果. 采用高效液相色谱法测定 5HMF 的含量，可不经分离，直接测定，其方法简便、准确、灵敏，重现性及回收率均符合要求. 在本实验给定的条件下，基线平稳，可有效排除溶剂峰的干扰，且峰型较好.【参考文献】1刘美丽，白玫，白荣枝，等. 熟地黄中 5 羟甲基糠醛的提取分离及
14、含量测定J.中草药，1995,26(1):13-14.2 耿放，王喜军. 5 羟基糠醛(5HMF) 在中药复方中的研究现状及相关药效探讨J. 世界科学技术 中医药现代化,2005, 7(6):52-54.3冯建明，赵仁. 三种地黄炮制品现代研究进展 J. 云南中医学院学报，2000,23(12):40-42.4楚文 ，张昌斌，曹永红，等. 限制 5 羟甲基糠醛生成条件和探讨J. 人民军医药学专刊 ，1998,14(2):101-103.5饶品昌，黄道明薄层扫描法测定熟地黄中 5 羟甲基糠醛的含量J. 中成药 ，1998,20(8):20-21.6张清波，乔菲，陈晓雪，等. HPLC 法测定熟地黄中 5 羟甲基糠醛的含量J. 中国药品标准，2001,2(4):33-34. 7秦向阳，周军，李晓曄，等. RPHPLC 法测定熟地黄中 5 羟甲基糠醛的含量J. 第四军医大学学报,2006,27（6）:510-511.
