1、脂质体包裹 TGF 反义脱氧寡核苷酸抑制人大肠癌细胞的增殖摘 要:目的 研究用转化生长因子 （TGF-）反义脱氧寡核苷酸（ASODN）对人大肠癌细胞株 HR8348 生长增殖的作用，探讨大肠癌治疗的新途径. 方法 采用人工合成的 TGF- 反义及无关对照 ODN 经阳离子脂质体包裹后转染人大肠癌 HR8348 细胞.采用 MTT 法， 3 H-TdR 掺入实验，细胞周期分析，裸鼠体内接种等方法测定瘤细胞体内外增殖的变化. 结果 经 TGF- 反义 ODN 处理的 HR8348 细胞与对照组 HR8348 细胞相比，体外增殖速度减慢（细胞增殖抑制率达 71%） ，DNA 合成受抑，裸鼠体内成瘤率
2、下降（25%vs100%）. 结论 TGF- 反义 ODN 能有效抑制大肠癌细胞的体内外生长增殖，可用于实验性肿瘤基因治疗研究. Keywords:colorectal neoplasms;transforming growth factor;oligodeoxynucleotides;cell line;liposome Abstract:AIM To investigate the effects of TGF-anti-sense oligodeoxynucleotides（ASODN）on human rectal carci-noma cell line HR8348.METHODS
3、 Cationic liposome and lipofectamine were selected as a delivery vector.HR8348cells were treated with ASODN in vitro.HR8348cells with or without pretreatment were inoculated into nude mice.RESULTS Proliferation and DNA synthesis of HR8348cells treated with ASODN were greatly inhibited and tumorigeni
4、c rate was greatly reduced.CONCLUSION TGF-ASODN could inhibit the proliferation of human colon cancer cell line in vitro as well as in vivo.The results implicate the potential value in colorectal cancer gene therapy. 0 引言 转化生长因子 （TGF-）在多种肿瘤中的过表达促进了瘤细胞的增殖、分裂，并与肿瘤的恶性表性有关 1 ，有报道称大肠癌组织中也存在 TGF- 的高表达2，3
5、.我们在查明 HR8348 细胞系存在 TGF- 高表达后，用 TGF- 反义脱氧寡核苷酸（ASODN）对其进行细胞转染，研究该反义脱氧寡核苷酸对该细胞系细胞生长的抑制作用. 1 材料和方法 1.1 材料 人大肠癌细胞株 HR8348 来源于 1 例男性直肠腺癌患者的手术切除标本，由中国医学科学院肿瘤研究所提供，培养在含100mLL-1 小牛血清的 RPMI1640（Gibco 公司）培养液，37，50mLL-1 CO2 的环境中. 1.2 合成硫代寡脱氧核苷酸 TGF- 反义脱氧寡核苷酸（ASODN）由18 个碱基组成，与 TGF-cDNA 前 3 个密码子及其上游部位 3 个密码子碱基序列
6、互补.反义链序列为 5-GGGGACCATTTTACGG-GC-3;无关对照寡聚核苷酸（N-ODN）由 18 个碱基随机组合，序列为 5-GCTAGGATCTGGAGCTCG-3，经基因库检索不与已有的已知编码序列相互补.以上 ODN 均用硫代磷酸修饰，由本校生物化学教研室合成. 1.3 脂质体 ODN 复合物的制备 阳离子脂质体LipofectAMINE4 购自 Gibco 公司，制备前将 ODN 稀释于 0.1mL 无血清无抗生素的 RPMI1640 中，加入同样方法稀释的脂质体，混匀，室温放置 510min，即可形成脂质体-ODN 复合物并立即用于细胞处理.脂质体与 ODN 用量参考说明
7、书. 1.4 细胞处理 用无血清无抗生素的 RPMI1640 稀释 HR8348 细胞，接种 0.8mL 细胞（约 1.5106 个）于 35mm 培养皿.将脂质体 ODN 复合物（0.2mL）加入培养皿，充分混匀，添加 4mL 含血清 RPMI1640 继续培养48h，而后收集细胞. 1.5 ODN 对 HR8348 细胞生长增殖的影响 采用 MTT 法及3 H-TdR掺入试验.取对数生长期细胞用无血清无抗生素 RPMI1640 稀释，接种40L 细胞（约 1104 个）于 96 孔培养板，加入脂质体-ODN 复合物，充分混合，培养 5h 后，添加 200L 含血清 RPMI1640 继续培
8、养 48h.而后吸弃上清，以 RPMI1640 清洗两遍，加入 RPMI1640 液200L，MTT（5gL-1 ）20L，37培养 4h 后吸弃上清液，每孔加二甲基亚砜（DMSO）200L，振荡 10min，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测其吸光度，每组复设 3 孔，取均值.设空白对照、阴性对照各 1 组.另 1 个 96 孔板中同上加入细胞及脂质体-ODN 复合物，培养 5h后添加 200L 含血清 RPMI1640 继续培养 24h，向培养液中加入3 H-TdR，培养 24h 后按文献5进行测定. 1.6 脂质体为载体对 ASODN 作用效率的影响 用 3末端标记法将-35 S标记
9、到 ASODN 上.将细胞（210 5 mL-1 ）铺种于 24 孔培养板，加入脂质体包装与未包装的-35 SASODN，终浓度为 10molL-1 ，置 3750mLL-1 CO2 孵箱中培养.分别于 24，48 和 72h 取出细胞，以PBS 洗涤，至上清液放射计数为 0.测定细胞中-35 S的放射活性. 1.7 细胞周期动力学分析 将处理细胞经胰蛋白酶消化后，制成1104 L-1 细胞悬液，碘化丙啶（PI）染色，FACScan 流式细胞仪测定. 1.8 裸鼠致瘤能力试验 裸鼠 11 只分成试验组、空白组、阴性对照组，分别为 4，3 和 4 只，每只于皮下注射 1107 细胞. 2 结果
10、2.1 ODN 对 HR8348 细胞 DNA 合成及生长增殖的抑制 TGF- 反义ODN 能抑制 HR8348 细胞的 DNA 合成及生长增殖.与空白对照组相比，肿瘤细胞生长增殖的抑制率为 71%， 3 H-TdR 掺入实验的抑制率为 73%.而经无关对照 ODN 处理的阴性对照组对 HR8348 细胞的生长增殖以及 DNA 合成无 显著抑制. 2.2 HR8348 细胞对35 SASODN 的摄入 结果表明，细胞对脂质体包装组的-35 S摄入量明显高于未包装组，这种差别随时间延长而更加显著（Tab1）. 表 1 HR8348 细胞对-35 SASODN 的摄入 略 2.3 细胞周期分析 T
11、GF- 反义 ODN 作用于 HR8348 后，细胞 G0 /G1 期细胞数明显增多，S 期细胞数相应减少，而 G2 +M 期细胞数亦明显的减少，而无关 ODN 组作用明显减弱，差异明显（Tab2）. 表 2 不同处理 HR8348 细胞周期分析 略 2.4 裸鼠皮下移植瘤生长 空白对照组 3 只及阴性对照组 4 只所有接种部位均有移植瘤形成且肿瘤体积大，成瘤率为 100%（3/3，4/4） ，TGF- 反义 ODN 处理 4 只，成瘤率低下（25%，1/4） ，且移植瘤生长缓慢，瘤体小（Tab3）. 表 3 ASODN 对 HR8348 细胞裸鼠皮下移植瘤形成的影响 略 3 讨论 随着分子生
12、物学技术的发展和对癌基因、生长因子及生长因子受体研究的不断深入，人们逐渐认识到生长因子及其受体在介导细胞信号转导、促进细胞分裂和增殖转化中占有重要地位.促瘤形成的自分泌和旁分泌机制的提出，促进了肿瘤发生机制的深入研究.有许多证据证明 TGF-在肿瘤细胞的恶性增殖中起一定作用，在许多恶性肿瘤中都发现有 TGF- 的过度表达，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、大肠癌2 及前列腺癌等，TGF- 可与 EGFR 结合而激活受体的酪氨酸酶活性，从而启动细胞有丝分裂，引起及诱导血管形成和肿瘤生长.已有实验证明，TGF- 可以通过自分泌机制在细胞的癌变中起一定作用6-10 . 本结果显示，TGF- 反义 ODN 对人
13、大肠癌细胞株 HR8348 的生长增殖和 DNA 合成均有抑制作用，经 TGF- 反义 ODN 处理后的肿瘤细胞的裸鼠体内致瘤能力明显下降，而经无关对照的 ODN 处理后的肿瘤细胞无此抑制作用，流式细胞仪的细胞周期分析结果也表明，经 TGF- 反义 ODN 处理的肿瘤细胞生长明显被阻滞于 G0 /G1 期，增殖指数（proliferation Index，PI）明显低于其他两组对照组，表明 TGF- 反义 ODN 可阻抑TGF- 与 EGFR 激活后所促发的细胞向 S 期过渡及由此导致的细胞过度增殖.TGF- 反义 ODN 对 TGF- 的抑制机制可能为:直接与 TGF- 的mRNA 结合诱发
14、内源性核酸酶对杂交体中 RNA 部分的水解;封闭酶结合位点;阻断前 mRNA 的剪切;与双链 DNA 的某一段特异性结合，形成三螺旋结构11-15 . 脂质体是由脂质双分子组成的环形封闭囊泡，无毒无免疫原性，使用方便.一些阳离子脂质体更被认为有应用前景16 ，因为这些阳离子脂质体一方面可以通过离子吸附方式结合带阴离子的 DNA，ODN 分子，另一方面又能与细胞作用，通过融合、内吞等方式将所携带的 DNA 或 ODN分子送入细胞. 我们观察了应用人工合成的 TGF- 反义 ODN 对人大肠癌细胞株HR8348 的作用.结果表明，TGF- 反义 ODN 能抑制 HR8348 的细胞生长增殖和 DN
15、A 合成，抑制了其在裸鼠体内形成肿瘤的能力.本研究对大肠癌发生机制的探讨和大肠癌的基因治疗有一定的理论意义和潜在的应用价值. 参考文献: 1Huang S，Trujillo JM，Chakrabarty S.Proliferation of human colon cancer cells:Role of epidermal growth factor and trans-forming growth factorJ.Int J Cancer，1992;52（7）:978-986. 2Messa C，Russo F，Caruso MG，Di Leo A.EGF，TGF-alpha，and EG
16、F-R in human colorectal adenocarcinoma J.Acta On-col，1998;37（3）:285-289. 3Shim KS，Kim KH，Park BW.Increased serum levels of trans-forming growth factor-alpha in patients with colorectal cancerJ.Dis Colon Rectum，1998;41（2）:219-224. 4Felgner PL，Gadek TR，Holm M.Lipofectin:A highly efficient lipid-mediat
17、ed DNA-transfection procedure J.Proc Natl Acad Sci USA，1987;84（21）:7413-7417. 5Situ ZQ，Wu JZ.Xibao Peiyang（Cell Culture） M.Xian:Shijie Tushu Chuban Gongsi（World Press Company） ，1996:193-194. 6Ciaradiello F，Bianco C，Normanno N，Baldassarre G，Pepe S，Tortora G，Bianco AR，Salomon DS.Infection with a trans
18、-forming growth factoranti-sense retroviral expression vector reduces the in vitro growth and transformation of a human colon cancer cell line J.Int J Cancer，1993;54（6）:952-958. 7Wang D，Li W，Jiang W，Humphrey LE，Howell GM，Brattain MG.Autocrine TGF-alpha expression in the regulation of inhi-bition of
19、human colon carcinoma growth J.J Cell Physiol，1998;177（3）:387-395. 8Hirsch T，Eggstein S，Frank S， Farthmann E，von Specht BU.Autocrine growth stimulation of SW403colon carcinoma cell line is caused by transforming-growth-factor-alpha-mediated epidermal growth factor receptor activation J.J Cancer Res
20、Clin Oncol，1996;122（6）:328-334. 9Normanno N， Bianco C，Damiano V.Growth inhibition of hu-man colon carcinoma cells by combinations of anti-epidermal growth factor-related growth factor antisense oligonucleotides J.Clin Cancer Res，1996;2（3）:601-609. 10De Luca A，Selvam MP，Sandomenico C，Pepe S，Bianco AR
21、，Ciardiello F，Salomon DS，Normanno N.Anti-sense oligonu-cleotides directed against EGF-related growth factors enhance anti-proliferative effect of conventional anti-tumor drugs in hu-man colon-cancer cells J.Int J Cancer，1997;73（2）:277-282. 11Mercola D，Cohen JS.Antisense approaches to cancer gene the
22、rapy J.Cancer Gene Ther，1995;21（1）:47-51. 12Wang L，Hui YL，Wang YS.Inhibition of antisense PCNA and antisense bcl-2oligodeoxynucleotides cultured human retinal pigment epithelial cells J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2000;21（2）:204-206. 13Shang ZC，Sun BZ，Feng Q.The synergistic effe
23、cts of bcr3/abl2and c-myb antisense oligodeoxynucleotides on chronic myeloid leukemia J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2000;21（3）:275-277. 14Chen BL，Ma XD，Mu RH.Induction of apoptosis in human cervical carcinoma cell line SiHa by antisense oligonuleotide of human papillomavirus typ
24、e16E6gene J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2000;21（3）:335-339. 15Mu RH，Chen BL，Zheng WG.Inhibitory effects of antisense oligonucleotides on the proliferation of cervical cancer cells J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2000;21（3）:357-359. 16Felgner JH，Kumar R，Sridhar CN，Wheeler CJ，Tsai YJ，Bor-der R，Ramsey P，Martin M，Felgner PL.Enhanced gene de-livery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations J.J Biol Chem，1994;269（4）:2550-2561.
