1、脂质体介导 hTERT 反义寡核苷酸对 HL60细胞增殖及凋亡的影响作者：关则兵 潘学谊 蔡小燕 【摘要】 目的 研究经脂质体介导转染端粒酶逆转录酶（hTERT）反义寡核苷酸(ASODN)对 HL60 细胞增殖、凋亡的影响。方法 运用四唑盐比色（MTT）法检测 HL60 细胞的增殖、Annexin VFITC/PI 双标记法细胞早期凋亡流式检测法检测 HL60 细胞的凋亡。结果 hTERT ASODN 组（终浓度 10 mol/L） 、脂质体介导 hTERT ASODN 组(终浓度 0.5 mol/L)均能抑制 HL60 细胞增殖，诱导 HL60 细胞凋亡，两组比较差异无显著性。各 ASODN
2、 组对 HL60 的抑制作用及诱导凋亡作用均弱于阿糖胞苷（终浓度 10 mol/L） （P0.01） 。结论 脂质体的介导增强了 hTERT AS0DN 抑制 HL60 细胞增殖及诱导凋亡的作用效果。脂质体介导 hTERT ASODN 有可能成为化疗外治疗急性白血病的有益补充。 【关键词】 脂质体；端粒酶逆转录酶；反义寡核苷酸；HL60 细胞；凋亡 Abstract:Objective To investigate the effects of liposomemediated hTERT ASODN on the proliferation and apoptosis of HL60 cel
3、ls. Methods To detect inhibition rate of HL60 multiplication by MTT and detect apoptosis by Annexin VFITC/PI double label method with FCM. Results The hTERT ASODN（10 mol/L）and liposomemediated hTERT ASODN(0.5 mol/L) all had the inhibitory effects on proliferation and inducing apoptosis of HL60 cells
4、, but there was no significant difference between the two groups. The inhibitory effects on cell proliferation and inducing apoptosis in the cytarabine group was stronger than the others（P0.01）. Conclusions The inhibitory effects on cell proliferation and inducing apoptosis of hTERT AS0DN were enhan
5、ced by liposome. Liposomemediated hTERT ASODN could be an additional method to treat acute leukemia besides chemotherapy.liposome；telomerase reverse transcriptase；antisense oligodeoxyn Key words:liposome；hTERT；HL60 cell；ASODN；apoptosis 恶性肿瘤的形成与端粒酶活性的升高有关1 ，白血病及其细胞株也存在着端粒酶活性的高表达2 。由于端粒酶逆转录酶（hTERT）是调节
6、端粒酶活性高低的限速决定因子3 ，故利用 hTERT mRNA 的反义寡核苷酸(ASODN)抑制端粒酶活性有望成为治疗白血病的手段4 。但在将外源基因引入靶细胞的过程中，很容易被体内的核酸酶降解，失去治疗作用。为探讨经脂质体介导后，能否提高 hTERT ASODN 抑制 HL60 细胞增殖及诱导凋亡的作用，笔者进行了以下研究。 1 材料与方法 1.1 实验材料 hTERT ASODN：序列为 5GGAGCGCGCGGC ATCGCGGG3 4 ，由上海 Sangon 生物工程公司合成，对其进行全硫代修饰及聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化；阿糖胞苷：哈尔滨博莱制药有限公司产品，产品批号：050
7、20701；阳离子脂质体 Lipofectin：美国 Invitrogen 公司产品，产品批号：50503。 1.2 细胞培养 HL60 细胞株培养基为含 10%（）胎牛血清、100 U/mL 青霉素，100 g/mL 链霉素的 RPMI1640 培养液，在 37 、5CO2 饱和湿度条件的培养箱中培养，23 d 常规传代换液培养，台盼蓝染色计数，维持细胞活力在 90%以上。取对数生长期细胞进行后续实验。 1.3 反义核酸 脂质体复合物的制备及转染 hTERT ASODN 加灭菌三蒸水充分溶解，浓度配制为 100 mol/L，-20 冰箱保存备用。按照脂质体说明书，取 100 mol/L AS
8、ODN 溶液 5 L(3.33 g)加入不含血清及抗生素的 RPMI1640 培养液 95 L，为A 液；取阳离子脂质体 Lipofectin 20 L(20 g)加入不含血清及抗生素的 RPMI1640 80 L，为 B 液。A、B 液分置室温 30 min 后，轻柔混匀，再置室温 15 min，即为反义核酸 脂质体复合物。取 HL60 细胞，5105/孔。每孔加不含血清及抗生素的 RPMI1640 培养 800 L，加入反义核酸 脂质体复合物 200 L（反义核酸终浓度为 0.5 mol/L） ，放入 37 CO2 孵箱中转染 6 h 后进行后续实验。 1.4 分组及加药方法 ASODN
9、组：取 HL60 细胞 1105，加入含 10%胎牛血清的RPMI1640 培养液 990 L、加入的 1 mmol/L ASODN 溶液 10 L（使其终浓度为 10 mol/L 4 ） ，培养 72 h；脂质体介导 ASODN 组：取转染后 HL60 细胞 1105，改换含 10%胎牛血清的 RPMI1640 培养液 1 000 L，继续培养 72 h；阿糖胞苷组：取 HL60 细胞 1105，加入含 10%胎牛血清的 RPMI1640 培养液 990 L、加入阿糖胞苷溶液 10 L（使其终浓度为 10 mol/L，参照文献报道的半数抑制浓度 5 ） ，培养72 h；空白对照组（常规培养体
10、系）：取 HL60 细胞 1105，加入含10%胎牛血清的 RPMI1640 培养液 1 000 L 培养 72 h。分别培养 24 h、48 h、72 h 收集(每组做 3 个平行孔)。 1.5 MTT 检测 取培养的细胞悬液量 0.5105，于培养体系内加入 5 mg/mL MTT 液20 L，相同条件下（37 5 CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中）培养 4 h。离心（1 000 rmin，5 min）后尽量去除上清液，每孔加入150 L DMSO，微量振荡器振荡 10 min。选择 570 nm 波长，在自动酶标仪上检测各孔光吸收值(A 值） 。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验孔 A
11、值）/对照组 A 值100%。 1.6 Annexin VFITC/PI 双标记法细胞早期凋亡流式检测 按 Annexin VFITC 凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司）说明书操作。收集细胞于 10 mL 的离心管中，调整待测细胞密度为0.5106/mL，取 1 mL，800 r/min 4 离心 10 min 弃去培养液。加入1 mL 冷 PBS 洗 1 次，800 r/min 4 离心 10 min 弃去上清，重复加入 1 mL 冷 PBS 洗 1 次，800 r/min 4 离心 10 min 弃去上清。将细胞重悬浮于 200 L 结合缓冲液。分别加入 Annexin VFITC
12、 10 L 和 PI 5 L，轻轻混匀，室温下避光孵育 15 min 或 4 反应 30 min。加入 300 L 结合缓冲液，立即上流式细胞仪检测。 1.7 统计学处理 数据均采用均数标准差(s)表示，使用 SPSS 统计软件，采用单因素方差分析（F 检验）及组间比较 t 检验，以 P0.05 为差异有显著性。 2 结 果 2.1 MTT 检测细胞增殖抑制率 ASODN 组、脂质体介导 ASODN 组对HL60 细胞增殖均有抑制作用，与空白对照组比较，差异有显著性。 2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率 ASODN 组、脂质体介导 ASODN 组均有增强诱导凋亡作用，与空白对照组凋亡率比较，差异
13、有显著性。表 1 脂质体介导 hTERT ASODN 对 HL60 细胞增殖抑制的影响与其他 3 组比较:P0.01；与空白对照组比较: *P0.05； *P0.012 脂质体介导 hTERT ASODN 对 HL60 细胞凋亡的影响与其他 3 组比较:P0.01；与空白对照组相比较:P0.01 3 讨 论 端粒酶与肿瘤发生相关，在正常人体细胞中导入端粒酶，细胞可获得永生化并形成肿瘤6 。hTER 基因是端粒酶活化的限制性组分，与端粒酶活性直接相关7 。hTER 基因表达于各种肿瘤细胞，白血病及其细胞株也存在着端粒酶活性的高表达，在 HL60 细胞高表达8 。阻断 hTER 基因表达可有效抑制
14、端粒酶活性，达到抑制白血病细胞增殖的目的。 ASODN 是根据碱基互补配对原则天然存在或通过人工合成的能高度特异性地封闭靶基因表达的一段寡核苷酸分子。ASODN 能与细胞表面的受体结合，通过胞饮作用进入胞质和细胞核。但外源性 ASODN 在体内很容易被核酸酶降解，利用阳离子脂质体包裹外源 ASODN，可使其免受核酸酶的降解，并协助 ASODN 穿透细胞壁进入细胞，提高细胞摄取 ASODN 的能力。另外，还可抵御核酸酶的作用，延缓 ASODN 降解。 本次实验显示，hTERT ASODN 组（10 mol/L） 、脂质体介导 hTERT ASODN 组(0.5 mol/L)均能抑制 HL60 细
15、胞增殖，诱导 HL60 细胞凋亡，两组间比较差异无显著性。但经脂质体介导的 ASODN 组的剂量仅为无脂质体介导组的 1/20。因此可以推断，脂质体的介导加强了 AS0DN 转染 HL60 细胞的能力，并增强其抑制细胞增殖及诱导凋亡作用效果。实验以文献报道的阿糖胞苷的半数抑制量（10 mol/L）作阳性对照，结果显示，各 ASODN 组对 HL60 的抑制作用及诱导凋亡作用均弱于阿糖胞苷（P0.01） ，但考虑到脂质体及 ASODN 均不存在化疗药物强烈的毒副反应，因此，脂质体介导 hTERT ASODN 有可能成为化疗外治疗急性白血病的有益补充。 【参考文献】 1KIM N W, PIATY
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