1、脂质体介导下重组 pcDNA3hBMP3 转染兔关节软骨细胞的条件 作者：韩一生，胡蕴玉，金格乐，李松建 【关键词】 基因 关键词: 基因;软骨细胞;骨形成蛋白 摘 要:目的 探讨基因转移效率与 pcDNA3-hBMP3 质粒及阳离子脂质体的浓度、转染时机以及细胞的种殖密度等因素的关系，以寻求最佳的基因转染条件. 方法 细胞密度按 2104 cm -2 接种后，对细胞接种后即时、孵化 2，5 和 7d 进行转染效率研究;G418 浓度每 mL DMEM 分别含有 200，300，400，500 和 600g，探讨G418 对软骨细胞的杀伤作用;选择不同细胞接种密度、不同脂质体浓度和pcDNA3
2、-BMP3 浓度，在细胞对数生长期且细胞融合至 70%80%时开始做转染，各组软骨细胞爬片的原位杂交结果通过计算机图像分析，以其灰度值判定基因转染的效率. 结果 最佳期的转染时机为软骨细胞接种后在孵箱内放置 2d 转染，即在软骨细胞对数生长期内做转染.G418 对软骨细胞的最佳筛选浓度为 400mgL-1 .最佳的细胞种植密度、pcDNA3-BMP3 浓度和脂质体的量应分别为 210 4 cm-2 ，5L和 10L. 结论 通过本研究探索出脂质体介导下 pcDNA3-BMP3 转染兔关节软骨细胞的最佳条件. Keywords:gene;chondrocyte;BMP Abstract:AIM
3、To explore the relationship between the ef-ficiency of the gene transfection in vitro and the amount of re-combination pcDNA3-hBMP3，the transfection opportunity and cell density ect to find the best situation of gene trans-fection to chondrocyts.METHODS We studied the different time points of transf
4、ection to find its best opportunity and the action of G418in different densities of200/300/400/500/600g in order to get its screen density.The different densities of chondrocytes of1104 cm -2 ，2104 cm-2 and1105 cm -2 ，and of profectamine adopt5，10and15L，and5g for amount of DNA were chosen.The transf
5、ection was done during cell logarithm growth period with the cell fusion of70%80%.Furthermore，we analyzed the in situ hy-bridization results of chondrocytes in each group through computer image，according to which the transfection efficien-cy was determined，and cell planting density and lipisome dens
6、ity to transfection efficacy were made.Under such densi-ties of pcDNA3-BMP3as2，5and10g，and with the pro-fectamine density of10L，the transfection was done2d af-ter cell vaccination.RESULTS The best opportunity of cell transfection was2d in incubator after vaccination，and the optimum screen density of
7、 G418to chondrocytes was400mgL-1 .The optimum cell planting density，optimum pcD-NA3-BMP3density and optimum lipsome density were2104 cm-2 ，5L and10L separately.CONCLUSION The best situation of transfection to chondrocytes in vitro was ob-tained through the study. 0 引言 体外细胞基因转染的效率往往与 DNA 和脂质体（lipofec
8、tamine）的浓度、转染时机以及细胞的种殖密度等因素密切相关，本实验拟探寻最佳的基因转染条件，旨在为研究重组 pcDNA3-hBMP3 转染对软骨细胞增殖的影响奠定基础. 1 材料和方法 1.1 材料 DMEM 培养基美国 Gibco 公司;胎牛血清（FCS）杭州生物制品厂;MTT;脂质体（lipofec-tamine）Sigma 公司;G418（新霉素）Gibco 公司;地高辛标记盒（德国宝灵曼公司）;pcDNA3-hBMP3 质粒. 1.2 方法 1.2.1 脂质体介导下 pcDNA3-hBMP3 转染软骨细胞的条件 转染时机:将细胞分为 4 组，A:细胞接种后（融合率 50%）即行转染
9、;B:接种后孵箱放置 2d（融合率 70%）转染;C:细胞接种后 5d（融合率90%）转染;D:细胞接种后 7d 转染（融合率近 100%）.各组转染条件一样，倒置显微镜低倍镜下统计阳性克隆的个数.G418 浓度:转染前对软骨细胞（密度为 2104 cm-2 ）进行 G418 浓度选择.G418 为每 mL DMEM 含有 200，300，400，500 和 600g，其标准为 G418 放入后，软骨细胞 34d 开始死亡，7d 后 95%细胞死亡.后在倒置显微镜低倍镜下观察培养瓶中存活细胞占总细胞的百分比.细胞种植密度和脂质体浓度:细胞密度分别为 1104 cm-2 ，210 4 cm -2
10、 和1105 cm -2 ，每 mL DMEM 含脂质体为 5，10 和15L，pcDNA3-BMP3 选择 5g.在细胞对数生长期且细胞融合率至70%80%时开始做转染.各组软骨细胞爬片的原位杂交结果通过计算机图像分析软件，以其灰度值判定转染的效率.细胞种植密度和 DNA 浓度对转染效能的影响:细胞密度为 110 4 cm-2 ，2104 cm-2 和 1105 cm-2 ，每 mL DMEM 分别含 pcDNA3-BMP3 为 2，5 和 10g，脂质体选择 10L.在细胞接种后 23d 开始转染.各组软骨细胞爬片与 hBMP3 的 cDNA 探针做原位杂交，原位杂交结果通过计算机图像分析
11、软件，以灰度值判定转染的效率. 1.2.2 转染后细胞爬片 hBMP3 的 cDNA 探针原位杂交方法 放置玻片后常规培养转染后细胞，等细胞长满玻片;收集爬片，加入固定剂（甲醇冰醋酸=31）2mL 预固定;逐级脱水后，用玻片封面.Dig-11-dUTP 标记探针1-3 参照地高辛试剂盒说明进行.细胞爬片原位杂交 4，5 :取出制备好的爬片三蒸水洗，0.02mLL-1 水室温浸泡 510min，0.2molL-1 HCl 室温浸洗10min;1.0ngL-1 蛋白酶 K 消化 10min;0.01molL -1 PBS（pH7.4）洗 3min2，40gL-1 多聚甲醛室温浸洗1030min;P
12、BS 或三蒸水洗 5min1;0.1molL-1 三乙醇胺缓冲液洗 5min;2mgL-1 醋酸酐（用 0.1molL-1 三乙醇受缓冲液配制）洗 10min，三蒸水洗;含 0.3molL-1 醋酸胺梯度乙醇（5001000mLL-1 ）脱水，室温晾干 510min;将标记的探针煮沸变性 10min，-20冰浴 3min，均匀滴加在玻片上，加盖玻片，湿盒中 372436h;爬片依次在 2SSC（2h2） ，1SSC（2h）振洗（水中去盖玻片 SSC 中过夜;洗净后蒸溜水冲洗;逐级乙醇脱水（5001000mLL-1 ） ，晾干，画蜡圈，蒸馏水洗; Buffer I 振洗 5min2;20mLL-
13、1 正常羊血清 封闭30min（用 3mgL-1 Triton X-100，Buffer I 配制） ，用封闭液稀释地高辛标记抗体（1500）作用玻片，室温或 37湿盒23h;Buffer I（100molL-1 Tris-HCl，150mmolL-1 NaCl pH7.5）洗 5min3;Buffer II（100mmolL-1 Tris-HCl，100mmolL-1 NaCl，50mmolL-1 MgCl2 ，pH9.5）洗 30s;NBT45L+BCIP35L+Buffer II10mL，37避光 13h，蒸溜水冲洗，终止反应，常规脱水，透明，封片.原位杂交组织切片经显微照相后，显微组织
14、照片用 Microtek E6 扫描仪扫描，图像采集入计算机，再用 Photoshop V5.0 图像处理软件分析，提取对照组中表达信号的灰度阈值，后根据不同组杂交结果的灰度值，计算平均灰度值.统计学方法用Base 统计软件进行统计学处理，团体 t 检验比较不同组的转染效能. 2 结果 2.1 转染时机 各组经 4wk G418 的筛选，同样转染条件下，第 2 组出现的阳性细胞克隆数目最多，与其他组比较具有明显的差异（P0.01，Tab1）.表 1 软骨细胞转染后阳性细胞克隆数（略） 2.2 G418 浓度对软骨细胞的杀伤作用 G418200gmL-1 对软骨细胞的杀伤作用轻微，10d 后大量
15、细胞仍有存活.300gmL-1 组 10d 后多数细胞死亡，但杀伤作用仍不够，易出现假阳性细胞克隆.对软骨细胞而言，最佳的 G418 筛选浓度应为 400gmL-1 ，此时个别软骨细胞 3d 开始死亡，7d 后未转染的细胞全部死亡（Fig1）.而 500gmL-1 和600gmL-1 G418 对软骨细胞的毒性太大，既使转染成功的软骨细胞也会被杀死（Fig2）.300gmL-1 与 500gmL-1 组和 600gmL-1 组差异显著（P0.01）. 2.3 细胞种植密度和脂质体浓度对软骨细胞转染效率的影响 软骨细胞爬片与 hBMP3 片段原位杂交结果通过计算机图像分析，以灰度值判定转染的效率
16、.可看出在细胞种植密度为 2104 cm-2 ，脂质体浓度为 10L 时软骨细胞的转染效率最佳，与其他组比较有显著性差异（P0.01，Tab2）.表 2 软骨细胞爬片 hBMP3 探针原位杂交灰度值（略） 、 2.4 细胞种植密度和 DNA 浓度对软骨细胞转染率的影响 软骨细胞爬片与 hBMP3 片段原位杂交结果，通过计算机图像分析软件以灰度值判定转染的效率.可看出在细胞种植密度为 2104 cm-2 ，DNA 浓度为 5g 时软骨细胞的转染效率最佳（Fig3） ，与其他组比较有显著性差异（P0.01，Tab3）.表 3 软骨细胞爬片hBMP3 探针原位杂交灰度值 3 讨论 细胞转染方法很多，
17、有脂质体、电击穿、颗粒轰击、磷酸钙沉淀和显微注射等8-13 .阳性脂质体（cationic liposomes 或lipofectin）是目前应用最多的介导转染方法，已商品化，应用极其方便，特别适合活 体基因转移.阳性脂质体是由脂质双分子层组成的环形封闭囊泡，它可和 DNA 形成脂质体 DNA 复合物，该复合物通过内吞方式入胞，从而使基因转入细胞.阳性脂质体也被认为是有效的体内转染载体，转染效率高，是其他化学方法的 5100 倍，临床已有在其介导下治疗囊性纤维化和黑色素质瘤的报道14 .Tomita 15 是脂质体介导下体内转染较早的研究者，他将 SVT 抗原基因构建于日本凝血病毒（HVJ）上
18、，后与脂质体（lipofectin）混合注入 Lewis 鼠关节内，3，7，14 和21d 取材，结果发现在鼠膝表层和中层软骨细胞约 70%有表达，说明脂质体介导的基因转染率较高15，16 . 多数学者都认为体外细胞基因转染的效率与多种因素有关，其中以细胞的类型关系最为密切，不同的细胞对同样的介导介质和转染基因其转染效率可不同，另外细胞的转染也与不同 DNA 和脂质体的量、转染时机和细胞的种殖密度等因素密切相关，这一方面无统一的方法和步骤可遵循，本实验对此做了深入探讨，以寻求最佳的基因转染条件.本研究发现对软骨细胞而言，最佳的 G418 筛选浓度应为每 mL DMEM 含G418400g，此浓
19、度下个别软骨细胞 3d 开始死亡，7d 后细胞全部死亡. 我们还发现细胞的种植密度和脂质体浓度对转染效率也有很大影响，最佳的种植密度和脂质体的量应分别为 2104 cm -2 和10L，而最佳的 pcD-NA3-BMP3 浓度应为 5g.原位杂交通过计算机图像分析，根据其灰度值判定转染的效率证明此方法简单易行，分析结果可靠. 参考文献: 1Davis HL， Demineix BA，Quantinm B.Plasmid NDA is superior to viral vectors for direct gene transfer in adult mouse skeletal muscle
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