1、 东方百合 AFLP 分子标记技术体系的建立摘要: 本研究以索蚌（Sorbonne） 、康斯坦撒（Constantza）及其杂交 F1 代为材料构建了东方百合扩增片段长度多态性 (AFLP)分析体系.采用改进的 CTAB 方法, 从东方百合中提取基因组 DNA, 琼脂糖凝胶电泳主带清晰、DNA 纯度高、较少降解、不含酶反应抑制剂, 可被 M se 和 Pst 两种限制性内切酶完全酶切。通过酶切连接、预扩增、选择性扩增、银染等试验过程, 成功建立了东方百合 AFLP 反应体系, 得到了清晰的指纹图谱, 试验结果重复性好.关键词：东方百合；AFLP；DNA 提取Establishment of A
2、FLP molecule labeling techniquesystem of Oriental HybridsAbstract In this paper， we used Sorbonne，Constantza and Its F1 hybrids as materials. AFLP ( amplified fragment length polymorphism ) analysis system for Oriental Hybrids was established in this study.The improved method of CTAB-DNA isolation w
3、as used to extract genome DNA from Oriental Hybrids. High quality genome DNA was obtained. Strips in agarose electrophoresis were clear and less decomposed. These DNA samples with high purification were intact without containing inhibitor of enzyme reaction and could be completely digested by restri
4、ction enzymes such as Mse and Pst inter sweet cultivars. The system suitable for silver stained AFLP analysis were established successfully by processes like restriction enzymes digesting ligating reaction, amplification reaction, and selective amplification. Sharp fingerprintings were obtained by t
5、hese processes, and the reproducibility was high.Key words:Oriental Hybrids; AFLP; DNA isolation东方百合学名“O riental Hybrids” ，是由 天 香 百 合 、 鹿子 百 合 、 日 本 百 合 、 红 花 百 合 与 湖 北 百 合 的 杂 交 获 得 的 栽 培杂 种 系 。 因 其 花 形 大 、 花 色 艳 丽 、 姿 态 高 雅 、 香 味 浓 郁 备 ，深 受 市 场 欢 迎 ， 逐 渐 取 代 亚 洲 百 合 ， 成 为 最 重 要 的 百 合 组 。荷 兰 和 美 国
6、成 为 世 界 百 合 的 培 育 中 心 ， 已 培 育 出 数 以 千 计 的品 种 ， 几 乎 垄 断 了 国 际 百 合 种 球 市 场 。 我国有着丰富的野生百合资源，全世界百合约有 97 个种，而起源于我国的就有 47个种和 18 个变种，约占世界百合属植物的一半，其中有 36 个种和 15 个变种为中国特有种。但是缺少拥有自主知识产权的优良百合品种，种球几乎完全依赖进口，而进口的种球种性退化快，严重制约着我国百合产业化的发展。. 随着分子生物学的发展, 出现了多种分子标记技术, 使从基因组水平探讨东方百合遗传变异成为可能. 扩增片段长度多态性(Amplified fragment
7、 length polymorphism , AFLP)是 1992 年由荷兰 Keygene 公司 Zabeau 和Vo s 在 PCR 和 RFL P 的基础上发展起来的新一代分子标记技术1.它既克服了 RFL P 技术复杂, RA PD 稳定性差、标记呈显性遗传的缺点,同时又兼有二者之长,具有分辨率高、稳定性好、高效率和高灵敏度等优点,实验结果稳定可靠 2,3. A FL P 产生丰富而稳定的遗传标记,可以用于遗传多样性、基因追踪、基因定位、分类、系统发育、品种鉴别、遗传图谱构建等各个领域 4.目前A FL P 技术在植物中的应用非常广泛,除了在小麦、水稻、玉米、大豆、花生等农作物中的应
8、用外,在蔬菜、花卉以及其他观赏树木中的应用也非常广泛 5,6.本研究以形态标记法选育出的东方百合为试验材料, 通过对 AFLP 反应体系各关键影响因素进行优化, 建立东方百合 AFLP 反应体系, 从而为构建东方百合的遗传图谱及分子标记辅助育种奠定了基础.1.材料与方法1. 1 试验材料1.1.1 植物材料供试材料为材料为索蚌（Sorbonne） 、康斯坦撒（Constantza）及其杂交 F1 代，均为试管培养保存。 （种植于南京林业大学花卉实验室温室）1.1.2 试剂限制性内切酶 Eco R、Mse(MB I)、引物、接头.、Taq酶、T4 连接酶1.1.3 仪器Bio-mini DNA/
9、 RNA/ Protein 分析仪、PCR 仪、D YY-6C 型电泳仪、垂直电泳系统 (Bio-radPower Pac 3000)、台式离心机及其它常用仪器。1. 2 试验方法1. 2. 1 DNA 的提取 分别采用改良 CTAB 法( 广东野百合 DNA 提取和 RAPD 条件的优化)和国产试剂盒提取试管培养新鲜叶子的 DNA，1% 琼脂糖凝胶电泳检测纯度和浓度，终浓度稀释到 100ng/l.两种方法提取的 DNA 都按 1.2.2-1.2.3 步骤进行AFLP 反应，以比较哪种方法适合 AFLP 技术。1.DNA 提取步骤( 粗提)(l)取 lg 新鲜百合叶片( 去掉基部叶脉密集部分)
10、放入研钵中，加入液氮，反复研磨 3 一 4次至叶片成很细的粉末为止;(2)将研磨成后的实验材料转入 10rnl 的离心管中，加入 4ml65预热的 CTAB 充分混匀，65水浴 45 一 60 分钟，期间振摇 3 次使提取液与实验材料充分反应;(3)加入等体积的氯仿/ 异戊醉(24:l)，轻缓颠倒离心管混匀，室温下静止 10min，12000r/min 离心 10min;(4)将上清液转入另一离心管中，重复步骤(3) 操作一次;(5)将上清转入新的离心管中，加入 1/10 体积的 3M 的 NaAc，再加入一 20冷却的异丙醉，轻缓颠倒混匀后冰上静止 30min;(6)6000r/min 离心
11、 3 一 5min，弃上清后将沉淀转入 lml 的新离心管中;(7)加入 1ml75%无水乙醉漂洗 3 次;(8)加入 1ml75%无水乙醉漂洗 1 次:(9)沉淀放置于室温或 65恒温箱至酒精味消失，加 500ul 灭菌TE 溶解，备用。2.DNA 粗提物的纯化(1)加入 2ulRNase 置于 37恒温箱中放置 60min 或者过夜;(2)取 2ul 处理后的 DNA 溶液电泳检测，观察 RNA 是否去除完全；(3)加入 500ul 碱酚:氯仿:异戊醉(25:24:l)，振摇使其充分混匀，静止 l0rnin，12000r/min 离心 10min;(4)取上清于一新的 1ml 离心管中，重
12、复步骤(3)操作一次，如果上清比较透明则可以不进行本次操作;(5)取上清于一新的 1ml 离心管中，加入灭菌 TE 至总体积为500ul，再加入等体积的氯仿 /异戊醇(24:l)，混匀后室温下静止10min，12000r/min 离心 10rnin:(6)取上清于一新的 1ml 离心管中，加入 40ul3M 的 NaAc 和一20预冷的无水乙醇 800ul，冰上静止 30min;(7)用手指轻轻弹出沉淀中的气泡，6000r/min 离心 3 一 5min;(8)弃上清，加入 1ml75%无水乙醇漂洗 3 次;(9)加入 1ml75%无水乙醇漂洗 1 次;(10)沉淀放置于室温或 65恒温箱至酒
13、精味消失，加 500ul 灭菌 TE 溶解。1. 3 AFLP 反应体系的建立1. 3. 1 DNA 样品酶切连接 酶切与连接采用 Invitrongen 公司的 AFLP Core Reagent Kit（包含 EcoR I/MseI，T4 连接酶和接头） ，体系与步骤参照产品说明书：（1） 酶切体系：2.5l DNA,5l 5X Reaction Buffer,2 l EcoR I/MseI,加 Distilled Water 至总体为 25l.（2） 37C 温浴 2 小时，然后 70C 灭活 15 分钟,使内切酶彻底失活，置于冰上。（3） 在第二步的酶切产物中加入 24 l Adapt
14、er/Ligation Solution 和 1 l of T4 DNA Ligase，总体积为 50l。（4） 20C 温浴 2 小时。（5） 产物用 TE 稀释 10 倍，-20C 保存。 1. 3. 2 DNA 片段的预扩增与选择性扩增反应体系和反应程序参照 Vos 和柯贤锋等方法，稍作改动。引物由英俊公司合成。表 1 预扩增反应体系（ Preamplification Reactions）Components Volume(l)ddH2O 12.710XPCR Buffer 2Mse-C Primer(10lmol/L) 1EcoR-A Primer(10lmol/L) 1dNTPs
15、Mix(10mmol/L) 0.5Mg(25Mm) 1.6Taq(5U/l) 0.2Ligated DNA（dilution 10 times）1预扩增反应程序：72C 2min;94C 30 s;56C 1 min;72C 1 min 30 s;30 轮循环；72C 10 min;4C forever.反应产物去 5l 经1%琼脂糖凝胶电泳检测，1:20 稀释用于选择性扩增。表 2 选择性扩增反应体系（Selective Amplification Reactions）Components Volume(l)ddH2O 11.710XPCR Buffer 2Mse Selective Pri
16、mer(10mol/L) 1EcoR Selective Primer(10mol/L)1dNTPs Mix(10mmol/L) 0.5Mg(25Mm) 1.6Taq(5U/l) 0.2Preamplified DNA( dilution 20 times)2选择性扩增反应程序：94C 5 min;94C 30 s;65C 30 s 以后每轮循环降低 0.7C，72C 1 min 30 s,12 轮循环；94C 30 s;56C 30 s;72C 1 min.24 轮循环；72C 6 min; C forever. 反应产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳和 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。2 结果
17、与分析2.1 DNA 提取如图 1，改良 CTAB 法提取的 DNA 浓度高，最高能能达到1000ng/l,但是点样孔亮，且 DNA 带型不够平整，表明氯仿多次抽提后任然有多糖等杂质。如图 2，试剂盒提取的 DNA 虽然浓度没有 CTAB 法提取的高，但是点样孔干净，带型平整，说明多糖等杂质去除干净。图 1 改良 CTAB 法提取的DNA图 2 试剂盒提取的 DNA DNA2.2 酶切与连接酶切连接产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，如图 3，片段在100bp-1000bp 呈现弥散带，亮度均一，表明酶切充分。500bp100bpM 1 2图 3 酶切连接产物1000bp2.3 预扩增如图 4 所
18、示，预扩增产物在 100bp-1000bp 之间呈现弥散带，有几条主带，点样孔干净，表明预酶切充分，连接完全，富集效率高，可作为选择性扩增的模板。500bp1000bpM 1 2 3 4 5图 4 预扩增产物100bp2.4 选择性扩增预扩产物必须经过稀释后才能做为选扩模板，稀释倍数受实验材料和预扩效果的影响。经过比较发现:稀释倍数在 20 一 70 倍的稀释倍数之间差异不太明显，但是 30 倍主带相对明显，所以选择稀释倍数为 30 倍。3.小结与讨论1) 实验材料收集问题。实验材料是实验进行的根本，实验样本采集地点，生境和数量取决于实验目的，同时又对实验结果的准确性和科学性有着重大影响.2)
19、 AFLP 实验操作问题。A 下 LP 实验过程复杂，工作量大，成本较高。因此为了避免失误造成工作量的增加和药品的浪费，要尽量在每一步完成时都进行检测。首先，高质量的基因组DNA 提取非常重要。因为 DNA 纯度不高会影响酶切连接顺利进行。为了酶切充分只能增加酶的用量和酶切时间，这样即浪费时间又浪费药品。另外扩增试剂的污染是非常值得注意的问题。AFLP 模板和引物较多，容易造成污染从而产生假阳性，所以加样时要特别小心，并做阴性对照防止假阳性的干扰。3) 电泳是 AFLP 结果检测中最关键的一步. 凝胶电泳一般用 5%的PAGE 胶、80W 恒功率、1. 52. 5 h, 结果是带型清晰, 分辨率在 50 800 bp. 若功率过高, 板易炸裂. 若扩增产物信号较弱, 变性时可抽去石蜡油或打开离心管的盖子, 使样品部分蒸发, 增加其浓度. 本试验是在冬季进行, 所得到的胶板常会因温度过低而变得模糊, 温度成为影响银染结果最主要的因素 . 因此, 除了
