1、,病毒学研究方法,病毒培养方法形态学研究方法免疫学(血清学)方法生化、生物物理与分子生物学方法,1、体外细胞培养技术二十世纪中期动物细胞体外培养技术的建立，极大推动了动物病毒学研究的发展原代成纤维细胞建株成纤维细胞上皮细胞,原代成纤维细胞 建株成纤维细胞 上皮细胞,Pig kidney cells (IBR-S2) growing on Cytodex 1.,Vero cells growing on Cytodex 1.,人二倍体细胞培养,接种细胞24小时,接种细胞72小时,收毒第3天,MDCK细胞,Vero细胞培养,接种细胞24小时,接种细胞48小时,接种细胞60小时,Vero细胞接种PE
2、DV病毒病变过程照片,Vero细胞培养,ST细胞,接种细胞24小时,接种细胞48小时,ST细胞,接种伪狂犬病毒病变过程照片,Marc-145 细胞,接种细胞24小时,接种细胞38小时,接种细胞50小时,Marc-145 细胞,接种PRRSV病毒病变过程照片,PK-15 细胞,接种细胞24小时,接种细胞36小时,接种细胞48小时,PK-15 细胞,接种TGEV病毒病变过程照片,MDCK 细胞,接种细胞24小时,接种细胞48小时,接种细胞72小时,MDCK 细胞,接种H9N2病毒病变过程照片,细胞培养技术在病毒学中的应用病毒生物学定量病毒克隆化获得遗传均一的病毒方便地生产病毒同步化研究病毒复制的过
3、程，提高实验的可重复性,病毒的定量并非所有的病毒颗粒都有感染活性有感染活性的病毒颗粒一般仅占总数的几 百到几万分之一,病毒的定量病毒的定量分为：物理颗粒的数量有感染活性的颗粒的数量有感染活性的颗粒的数量，更有生物学意义特称为或Titre)病毒的效价 (Titer Titre,病毒效价的测定（之一） 空斑测试（plaque assay）用稀释的病毒液感染单层细胞，盖上琼脂，限制病毒的流动病毒感染造成局部细胞死亡或病变，形成肉眼可见的“斑”或“空斑”（噬菌体中：噬菌斑）根据“斑”的数量和稀释倍数可以统计病毒的效价,病毒空斑,未感染的细胞被染成红色,病毒空斑,显微镜下的空斑 带有LacZ基因的重组病
4、毒形成的空斑,病毒效价的测定（ 多孔板终点稀释法）病毒逐级稀释接入长有细胞的孔中，培养后观察各孔中细胞是否被感染，计算TCID50 （Tissue Culture 50% Infection Dose 一半的孔被感染时的稀释度）,病毒效价的相对性用不同的细胞株去测定病毒的效价，可能会得到完全不同的效价数据需要标准化,病毒感染复数(Multiplicity of Infection, MOI),病毒感染复数：病毒感染细胞时平均每个细胞的病毒数,1万个细胞，为了保证99%细胞感染病毒，至少有一个病毒感染，共需要多少病毒？病毒感染细胞是随机的独立事件 群体感染时，有的细胞被1个病毒粒子感染，有的被2
5、个病毒粒子感染有的可能没有被病毒感染 病毒感染细胞的情况，符合泊松分布：p(k)=e-mmk/k!(其中m：病毒感染复数，p(k)：细胞被k个病毒感染的几率)所以：未被感染的细胞的比率： p(0)= e-m被1个病毒感染的细胞比率：p(1)= e-mm被2个病毒感染的细胞比率：p(2)= e-mm 2 /2,问题：pfu与TCID50 间的换算关系是：1TCID50 =0.7pfu为什么？,感染复数对病毒感染的实验结果有很大影响低感染复数时感染不同步高感染复数时病毒易产生变异 不同的实验要求不同的感染复数,2、活体培养方法仍有许多病毒缺乏可供其复制的离体细胞培养系统如：乙肝病毒，大多数植物病毒
6、活体系统还可提供病毒与宿主相互作用的信息免疫反应致病机理治疗方法最常用活体系统之一：鸡胚,鸡胚用于繁殖病毒、制备疫苗,鸡胚的构造和病毒培养,流感病毒,单纯疱疹病毒,病毒在鸡胚中的繁殖流感病毒单纯疱疹病,活体培养方法免疫缺陷动物(SCID 小鼠）对病毒感染无免疫排斥可接入人的免疫细胞等，使之具有人的免疫功能，用于研究 HIV、疱疹病毒等与免疫系统的相互关系SCID：severe combined immunodeficient,二、病毒形态学研究方法1、光学显微镜病毒细小，一般光学显微镜下不可见但有时可见病毒聚集，或衍生形成的包涵体,狂犬病毒包涵体,病毒包含体,昆虫杆状病毒的多角体,2、电子显微
7、镜,噬菌体负染，透射电镜 疱疹病毒感染细胞的超薄切片，透射电镜,新的电镜技术冰冻电镜低辐射电镜,冰冻电镜图像重构技术,冰冻电镜解析病毒结构,一种绿藻病毒的冰冻电镜重构,冰冻电镜解析病毒结构,质型多角体病毒冰冻电镜图,X射线晶体学通过X射线衍射研究病毒中原子、分子的排列,研究可形成晶体的病毒,荧光显微镜,新的荧光显微镜技术用于实时跟踪AAV 入侵的过程,三、免疫学方法病毒学与免疫学是密切相关的免疫技术在病毒学中的应用利用抗原抗体反应的专一性进行：病毒的检测病毒的鉴定分型病毒的定量特异性抗体的监测,常用免疫学技术血球凝集试验补体结合试验酶联免疫吸附试验（ELISA）免疫印迹试验（Western b
8、lot）免疫荧光组织化学免疫胶体金标记免疫共沉淀,血球凝集试验某些病毒具有与血细胞表面多糖分子结合的蛋白（基团）。如流感病毒，风疹病毒,补体结合试验游离的补体可导致抗体包被的红血球破裂(溶血)但当有抗原-抗体复合物存在时，补体就会与抗原-抗体复合物结合，可避免溶血。由此可检测是否有特定的抗原或抗体存在,补体结合试验：测定特定抗原的量抗体（抗血清）与待测抗原样品混合 加入一定量的补体 加入包被抗体的红血球 测定溶血,酶联免疫吸附试验（ELISA）用酶标记的抗体灵敏地定量检测病毒抗原,ELISA: Enzyme linked Immuno-Sorbent AssayA 双抗夹心B 间接法,ELISA检测抗体,A：抗原E：标记酶S：低物,四、生化、生物物理与分子生物学方法生物物理方法：离心技术病毒颗粒分离纯化病毒颗粒的大小、沉降系数测定 生物化学方法病毒颗粒生物化学组分分析：蛋白质分析核酸分析其它组分分析,分子生物学方法举例：病毒反向遗传学方法,从合成基因到合成病毒： 人工合成脊髓灰质炎病毒,
