1、土壤中蛔虫卵检测,湖南省疾病预防控制中心,原理采样方法注意事项鉴别（受精与未受精、死活）,大纲,先用碱性溶液与土壤样品充分混合以分离蛔虫卵与土壤颗粒，再加入比重较大的液体使得比重较轻的蛔虫卵漂浮在溶液表面，收集后镜检计数。,原理,1、分别从土表及5厘米深处采取土样，因为虫卵存活时间与土层深度有关；2、在用人粪施肥的农场和菜地可分别在陇上和犁沟中取土样，同时还应取20厘米深处的土样，以确定虫卵附着在根块植物上的可能；3、为了测定不同局部气候条件下虫卵存活率，要从有日光照射和荫蔽区采取土样；4、厕所、庭院、厨房取表层土；5、每份土样约50100g。,采样,1、土样处理：剔除菜叶、树皮等大杂物，压碎
2、土样中的大颗粒；然后用孔径3mm的铜筛和孔径为2mm的铜筛过筛，收集过筛后的土样。2、分离：取50ml大离心管，放入过筛后的土样10g，加5%氢氧化钠溶液至40或45ml刻度线。用橡皮塞紧塞管口，在振荡器上振荡15分钟，可反复34次，待充分混合后，以2000rpm,离心4min。3、漂浮：弃去上部的氢氧化钠，加入饱和硝酸钠溶液充分搅拌混匀，2000rpm离心4min，再加饱和硝酸钠溶液满至管口，覆上18mm18mm盖玻片。4 、计数：静置15min后，将盖玻片迅速翻转取下，置于载玻片上镜检，同时再覆上第二张盖玻片，如此反复，共计数34张盖玻片。,方法,1、 漂浮液的比重：漂浮液的比重是影响蛔虫
3、卵检出率的重要因素，用比重大的溶液作为漂浮液效果较为理想，与饱和硫酸锌、硫酸镁、氯化钠等盐溶液相比，饱和硝酸钠的比重最高，用作漂浮液蛔虫卵的检出率最高。2、土壤性质：土壤性质决定了虫卵与土壤颗粒粘合的程度，蛔虫卵检出率沙土最高，壤土次之，粘土最低。3、离心的时间与次数：延长离心时间、提高离心速度或增加离心次数均可以提高蛔虫卵与土壤颗粒的分离效果进而提高检出率。,注意事项,鉴别-受精与未受精,受精蛔虫卵呈短椭圆形或圆形，卵壳厚，双线层，外包一层乳头状突起的蛋白膜，呈棕黄色。,未受精蛔虫卵与受精卵相比显得狭长，多为长椭圆形，卵内充满大小不等油滴状卵黄颗粒。,1. 含一个卵细胞活受精蛔虫卵， 外包有
4、乳头状突起的蛋白膜。,2. 脱蛋白膜活受精蛔虫卵,3. 含2个卵细胞活受精蛔虫卵,4. 含4个卵细胞活受精蛔虫卵,5. 含8个卵细胞活受精蛔虫卵,6. 含16个卵细胞活受精蛔虫卵,7. 桑椹期脱蛋白膜活受精蛔虫卵,8. 含幼虫的活受精蛔虫卵,9. 未受精蛔虫卵外包锯齿状 突起的蛋白膜,10. 脱蛋白膜的未受精蛔虫卵,鉴别-死活,活的受精蛔虫卵：内含一个球形的卵细胞，卵壳两端和卵细胞之间，有半月形的空隙，卵内的卵黄颗粒清晰而致密；若卵内含幼虫，虫体的前后部没有颗粒，中部颗粒清晰而有金属光泽，有立体感，镜检时，注视或轻压，可见有轻微蠕动，强压后，有时可挤出幼虫。,死受精蛔虫卵(变性卵)：卵细胞移向
5、一端，或向不定部位呈球状收缩，致使卵壳两端呈现有大小不等的半月形空隙；卵内脂肪变性，形成空泡；卵细胞颗粒减少或消失；细胞质浑浊，呈黑色或棕黑色；卵壳的一侧或两侧向内凹陷或破裂；只有蛋白质壳，而缺内容物。若卵内含幼虫，虫体内几乎充满颗粒，且模糊不清，无金属光泽，缺乏立体感，久久不见蠕动，稍稍加热或轻压，不会蠕动；强压时，虽能挤出幼虫，但也不改变其原来的卷曲 状态。,11. 外包蛋白膜的死受精蛔虫卵， 卵细胞移向一端,12. 脱蛋白膜的死受精蛔虫卵， 卵细胞移向一端,13. 桑椹期脱蛋白膜死蛔虫卵,14. 死受精蛔虫卵，在卵细胞 上部可见透明细胞质,15. 外包蛋白膜死受精蛔虫卵，卵内 脂肪变性，
6、细胞质形成空泡。,16. 脱蛋白膜死受精蛔虫卵，在卵细 胞上部形成空泡。,17. 卵细胞皱缩死受精蛔虫卵,18. 空泡化死受精蛔虫卵,19. 卵细胞崩解的死受精蛔虫卵,20. 卵细胞崩解的死受精蛔虫卵,21. 卵细胞不规则裂开的死受精蛔虫卵,22. 卵胚变形的死受精蛔虫卵,23. 内含物变形死受精蛔虫卵,24. 卵壳内幼虫变形的死受精蛔虫卵,死活蛔虫卵形态,正常发育过程中蛔虫卵-活受精蛔虫,1.单细胞期活受精蛔虫卵2.二细胞期活受精蛔虫卵3.四细胞期活受精蛔虫卵4.多细胞期活受精蛔虫卵,5.桑椹期卵（卵胚一端透明有光泽）6.蝌蚪期卵（卵胚的一部分凹陷）7.仔虫期卵（可见幼虫呈8字状运动）8.不
7、均等发育，卵内一部分发育为仔 虫期，一部分为蝌蚪期,死受精蛔虫卵,1.卵细胞颗粒化 2.卵细胞萎缩3.卵细胞空泡化 4.卵细胞质的周边部透明化,染色法,美蓝、伊红、硼砂染色法原理美蓝、伊红、硼砂染液（简称M.E.B）溶于水呈碱性。活虫卵可以还原碱性染料，降低着色力，不易被染色。死虫卵不能还原碱性染料，容易着色。蛔虫卵外层蛋白膜容易被着色，染色前需脱去蛋白膜。配制将0.2g美蓝加入100ml蒸馏水中煮沸10分钟，加入硼砂0.5g，再煮沸10分钟，冷却后加入伊红0.1g，待完全溶解后过滤备用，pH值为1011，在室温中可放置1.5年。,步骤1、脱蛋白膜将收集的蛔虫卵加入30%次氯酸钠，作用数分钟，
8、并经常振荡，再用蒸馏水洗2次，即可脱掉蛋白膜。,2、染色镜检 吸取虫卵沉淀物一滴置于载玻片上，加M.E.B染色液一滴，上覆盖玻片，静置35分钟后镜检。或者，吸取虫卵沉淀物1滴放入小试管内，加入染色液染30分钟，再用蒸馏水洗23次，吸取沉淀物镜检。3、注意 M.E.B的PH值应在10左右，不宜太高； 脱蛋白膜后，应洗净次氯酸钠，否则影响碱性染料的着色效果。4、鉴别死活 活卵内含物不着色，死虫卵内含物染成蓝色。,图中箭头所指为死的蛔虫卵,培养法,1、在直径1012cm的玻璃平皿底部平铺一层厚约0.5cm的脱脂棉；2、在脱脂棉上铺一张直径与平皿等大的普通滤纸；3、在滤纸上，再放一张直径2cm的小滤纸，将虫卵滴在小滤纸片上；4、加入2%福尔马林液，以湿透滤纸和脱脂棉；5、放入在2830温箱中培养1个月观察虫卵死活。6、培养一个月后自皿中取出小滤纸片，将虫卵置于载玻片上，滴加50甘油溶液，使其透明后，根据形态，鉴定卵的死活。凡含有幼虫的，都认为是活卵，其他阶段的或单细胞的，都判为是死卵。,
