1、- 1 -华 南 师 范 大 学 实 验 报 告学生姓名 林 鸿 锦 学 号 20070004002 专 业 综合理科二班 年级、班级 07 级 课程名称 生物化学实验 实验项目 氨基移换反应的定性鉴定 实验类型 验证 设计 综合 试验时间 2008 年 11 月 23 日实验指导老师 陈 文 利 实验评分 一、 目的学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及原理。二、 原理氨基移换酶也称转氨酶,它能催化 -氨基酸的氨基与 -酮酸的 -酮基互换，这种作用称为氨基移换作用。转氨酶的种类甚多，任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。它们的最适 pH 接近 7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸草
2、酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶、GOT）及谷氨酸丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶、GPT）活力最强。其催化反应如下：上述两种酶均广泛存在于生物机体中，在正常人血清中也有少量存在。机体发生肝炎、心肌梗塞病变时，血清中转氮酶活力显著增加。本实验利用纸层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸，证明组织内氨基移换作用。为了防止丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还原，可加碘乙酸或溴乙酸抑制酵解作用或氧化作用。三、 材料、试剂和器具（一） 材料家兔（饥饿 16h）- 2 -（二） 试剂1、1%谷氨酸溶液（用 1%KOH 溶液中和）2、1/15mol/L 磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）3、1%丙酮酸
3、溶液（用 1%KOH 溶液中和）4、0.05%碘乙酸溶液5、30%乙酸6、标准丙氨酸溶液（0.5%）7、标准谷氨酸溶液（0.5%）8、0.1%水合茚三酮乙醇溶液9、酚溶剂（实验室已备）（三） 器具1、 剪刀2、 圆规、铅笔、直尺3、 毛细管4、 电吹风机5、 恒温水浴6、 滤纸7、 培养皿8、 试管及试管架四、 实验过程（一） 制备肝匀浆实验室已准备好肝匀浆。（二） 酶促反应取 2 支干净试管，编号，按下表操作。试管编号 1（待测） 2（对照）1%谷氨酸溶液（滴） 10 101%丙酮酸溶液（滴） 10 101/15mol/L 磷酸缓冲液（mL） 2 20.05%碘乙酸（滴） 5 5新鲜肝匀浆（
4、mL） 2 -煮沸过的肝匀浆上层液（mL） - 2将两试管摇匀，置于 37恒温水浴中保温 40min。30%乙酸（滴） 5 5两试管置于沸水中加热 10min。现象及分析 暗褐色沉淀（蛋白质变性） 乳白色浑浊（蛋白质在前面 煮沸时已沉淀）流水下冷却，过滤，取滤液备用。保温前（左均为待测管） 保温后 沸水浴后（三） 纸层析- 3 -取 15cm 直径的圆形滤纸，在圆心处用圆规划一个 3cm 的同心圆。在同心圆的圆周上取4 个点， 每个点的距离相近，为点样的位置。用 4 支毛细管口分别取样品（1 号点）和对照的滤液（2 号点） ，以及标准谷氨酸（3 号点）和丙氨酸（4 号点） ，再轻轻触到 4 个
5、点样的位置上，使每种溶液分别形成直径为 2-3mm 的圆斑，每次点样后，自然风干或吹风机吹干，再点下一次，重复 3-4 次。在 15cm 直径的圆形滤纸中心剪一个小圆孔。取一滤纸 卷成圆筒，用剪刀将该圆筒状的滤纸的下端沿纵向剪为灯刷 状，而滤纸的上端插入至 15cm 直径的圆形滤纸的小圆孔中（不 突出纸面） 。圆筒装的滤纸灯刷状的一端放在盛有层析剂的培养皿 中，灯刷状的滤纸和层析剂相接触。培养皿上盖上大小一样的 培养皿，纸上层析开始。待层析剂展开至 15cm 直径的圆形滤 纸边缘 1cm 时，纸上层析结束。取出滤纸，晾干或吹干，以除去酚溶剂。用喷雾器向 显色后 滤纸均匀喷洒 0.1%茚三酮乙醇
6、溶液。用风筒吹热风使滤纸中温度加热至 60-80，使氨基酸显色。（四） 计算及分析显色结果见下表：编号 1 2 3 4斑点与点样点距离（cm） 2.0 2.3 3.0 2.0 2.3 3.2溶剂与点样点距离（cm） 4.1 4.2 4.8 4.5斑点颜色 紫色 肉色 紫红色 紫色 紫色 紫红色Rf值 0.488 0.561 0.732 0.455 0.479 0.711注：R f值=斑点中心与点样点距离/溶剂前沿与点样点距离结果分析：（1）根据测量及计算的结果，R f值为 0.488、0.455、0.479 的三个斑点应为同一种氨基酸谷氨酸。因为它们的 Rf值相近，而且斑点颜色相同。同样道理，
7、R f值为 0.732 和 0.711 的斑点则为丙氨酸。（2）1 号点中出现了 Rf值为 0.561，颜色与其他的不同的斑点，应该是兔肝中的其他种类氨基酸，并且不止一种。（3）根据结果可以推断出，新鲜肝匀浆中的谷丙转氨酶将部分丙酮酸转化成丙氨酸，谷氨酸则转化成 -酮戊二酸。由于溶液里面还有未转化的谷氨酸，加上肝脏中的其他种类氨基酸，所以呈现出 3 个斑点。而煮沸过的肝匀浆中酶已失活，无法发生移换作用，因此还是只有谷氨酸。（4）相同种类氨基酸的 Rf值并不完全一致，应该是与苯酚溶剂在滤纸上的扩散不完全均匀、规则有关。五、 实验讨论（一） 实验改进本实验我们用来作层析剂的溶液是苯酚。苯酚是一种有
8、毒物质，有强烈的刺激气味，对皮肤有较强的腐蚀性，而目价格较贵。那么有没有替代品呢？带着这个疑问我到网上搜寻资料，发现有人用无水乙醇+水+尿素的配方取代了苯酚溶液，并有较好的效果。- 4 -（1）与本实验不同之处：采用的层析剂为无水乙醇+水+尿素（80：20：0.5） ，并且在层析时，直接将茚三酮加入到层析剂中。其他操作与本实验类似。（2）资料上的实验结果显示，用新旧两种配方进行层析后氨基酸的迁移率基本相同，可见改进取得了明显效果。（3）新展层剂中使用乙醇的优点：新展层剂的成分为乙醇、水和尿素，比较原有的层析剂，新配方具有以下优点:一、安全无毒，没有腐蚀性，对人体没有副作用;二、与苯酚相比较，乙
9、醇价格便宜；三、由于没有腐蚀性，且易挥发，在实验操作中，无须戴手套，也不用在通风橱中进行，这些都大大的简化了实验的操作过程，缩短了实验时间，给实验人员带来了极大的方便。（4）显色方法的比较：原实验中的层析剂没有加入茚三酮，故等滤纸干后要将茚三酮乙醇溶液喷在滤纸上显色。在这个操作过程中茚三酮的量无法固定，会使茚三酮很难均匀的喷在滤纸上，色斑显色不均匀，易扩散，甚至会被冲散，使得滤纸表面显得很不干净，影响 Rf 值的测定。为了克服传统喷雾显色造成的重现性差的缺点，本实验改进了显色方法，将一定量的茚三酮溶解于层析剂中，在层析过程中，茚三酮随层析剂沿滤纸向四周扩散，由于固定了显色剂的量，茚三酮与 -氨
10、基酸共热，生成还原型水合茚三酮，还原型水合茚三酮再与茚三酮反应生成蓝紫色化合物，故吹干后滤纸上能看见蓝紫色色斑均匀分布在滤纸上，显色效果较好，滤纸表面比较十净，利于 Rf 值的测定，大大缩短了实验时间，使操作更简单，效果也很好。综上所述，用无水乙醇、水、尿素按照 80:20:0.5 的比例配制的新层析剂，可以代替原有的苯酚和水的层析剂，同样能够较好的分离氨基酸，对人体没有任何毒性和腐蚀性，简化了实验步骤；另外，将茚三酮加入新展层剂中，能够更好的显色，实验时间大大缩短，优化了实验结果，达到了改进实验的目的。（二） 拓展：测谷丙转氨酶的临床意义谷丙转氨酶（简称 GPT、ALT）升高在临床是很常见的
11、现象。肝脏是人体最大的解毒器官，该脏器是不是正常，对人体来说是非常重要的。GPT 升高肝脏功能出现问题的一个重要指标。在常见的因素里，各类肝炎都可以引起 GPT 升高，这是由于肝脏受到破坏所造成的。一些药物如抗肿瘤药、抗结核药，都会引起肝脏功能损害。大量喝酒、食用某些食物也会引起肝功能短时间损害。 GPT 主要存在于肝细胞浆内，其胞内浓度高于血清中 1000-3000 倍。只要有 1%的肝细胞坏死，就可以使血清酶增高一倍。因此，GPT 被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。但它并不具器官专一性，许多疾病都可以引起它的增高。明显升高见于急性病毒性肝炎，中度升高见于慢性肝炎、肝硬化活动期
12、、肝癌、肝脓肿，心梗、心肌炎、心衰等也可轻度升高。因此对 GPT 升高的评价应密切结合临床。部分 GPT 升高与脂肪肝、饮用酒精有关。临床常用的保肝药物较多。但有些药物治疗效果可以但容易反复，致使一些肝脏疾病长期不能治愈，大量的肝细胞遭受破坏。如何保护肝细胞，是保护肝脏功能的关键所在。 谷丙转氨酶，主要存在于肝脏、心脏和骨骼肌中。肝细胞或某些组织损伤或坏死，都会使血液中的谷丙转氨酶升高，临床上有很多疾病可引起转氨酶异常，必须加以鉴别 病毒性肝炎、中毒性肝炎、大量或长期饮酒、肝硬化与肝癌肝硬化活动、胆道疾病、 心脏疾病、其他某些感染性疾病，如肺炎、伤寒、结核病、传染性单核细胞增多症等，都有转氨酶升高的现象，但这些疾病各有典型的临床表现，并可借助实验室检查，明确诊断。此外，急性软组织损伤、剧烈运动，亦可出现一过性转氨酶升高。所以你需要到医院做一个比较全面的检查，才能找出原因，及时处理。- 5 -【参考文献】1许秀珍，梁山.生物化学与分子生物学实验指导M.广州：暨南大学出版社，2003.102-1052王筑婷等. 圆形纸层析法鉴定转氨基作用的实验改进J. 贵阳医学院学报，2008，33（4）：418-4193 http:/
