1、 HIV 感染后外周血肠道归巢 CD8 细胞及其亚群变化特点研究彭巧丽，唐娴，蔡侃儒，蒋强，李桂英，王辉（深圳市第三人民医院，广东，深圳，518112）摘要：目的 探讨 HIV 感染后外周血肠道归巢 CD8+ T 细胞及其功能亚群变化特点。方法 选取 85 例符合诊断标准的慢性 HIV 感染患者，根据抗病毒治疗与否，将其分为 2 组：治疗前 43 例，治疗后 42 例，同时选取 45 例健康志愿者为对照。采用流式细胞表面染色及全血胞内细胞因子染色方法，使用 BD FACSCanto 流式细胞仪检测各项指标，FACSDiva 软件分析肠道归巢 4+7+RO+CD8+T 细胞及其功能亚群Tc17
2、和 Tc1 的变化情况，将结果进行统计学分析并比较各组之间的差异。 结果 HIV 感染患者外周血4+7+RO+CD8+T 细胞百分比及绝对值均显著高于健康对照（14.74+ 7.74% vs 5.53+2.66%，P=0.000；96.19+68.92 vs 24.59+9.48，P=0.000 ） ，经过抗病毒治疗后，肠道归巢4+7+RO+CD8+T 细胞百分比可恢复至正常水平（6.91+ 5.37% vs 5.53+2.66%，P=0.100 ） ，但其绝对值仍显著高于健康对照组（49.35+44.23 vs 24.59+9.48，P=0.000） ；HIV 感染后 4+7+RO+CD8+
3、Tc1 细胞百分比及绝对值均显著增高（86.48+12.59% vs 73.66+14.60%，P=0.000 ；91.50+65.97 vs 20.97+9.73，P=0.000） ，经过抗病毒治疗，可部分下降但仍不能降至正常水平（82.59+ 13.03% vs 73.66+14.60%，P=0.000；40.51+65.97 vs 37.00+9.73，P=0.000） ；而 4+7+RO+CD8+Tc17 细胞百分比在HIV 感染后显著降低（1.08+1.59% vs 4.51+3.41%，P=0.000） ，经过抗病毒治疗后可基本恢复至正常水平（2.99+2.28 vs 4.51+3
4、.41%, P=0.0916） ，但 4+7+RO+CD8+Tc17 绝对值治疗前后无明显变化，基本维持在正常水平（P ）0.05） 。结论 外周血 4+7+RO+CD8+T 细胞作为可以间接反应肠道 CD8 细胞变化的可靠指标，在 HIV 感染后显著增高，而其功能亚群则出现平衡紊乱，在 HIV 致病机制中可能起重要作用，对其变化特点的追踪可以为疗效监测及疫苗研究提供重要的循环标志。关键词：HIV ；AIDS ；肠道归巢 CD8；Tc1；Tc17A Study of Peripheral Gut-homing CD8 Cell and subpopulation in HIV Infectio
5、n1PENG Qiao-li, TANG Xian, CAI Kan-ru, JIANG Qiang, LI Gui-ying, WANG Hui（ Shenzhen Third Peoples Hospital, Guangdong, Shenzhen ,518112,China）Corresponding author: Wang Hui, Email: . Supported by Shenzhen science and technology innovation plan: JCYJ20150402111430627 /JCYJ20140411111718169Abstract: O
6、bjective To evaluate the characteristics of peripheral gut-homing CD8 T cell and its subpopulation after HIV infection. Methods 85 chronic HIV infected patients as well as 45 healthy volunteers were performed in this study. The patients were divided into two groups, one before treatment, the other a
7、fter therapy. The whole blood surface and intracellular cytokine staining were used, samples detected by BD FACSCanto, after that , the expression of gut-homing 4+7+RO+CD8+T cell and its subpopulation Tc1 and Tc17 were analyzed by FACSDiva software and lastly compared the differences among different
8、 groups. Results The percentage and absolute number of 4+7+RO+CD8+T cell in nave-therapy patients were significantly increased 基金项目：深圳市科技创新计划“肠道归巢 T 淋巴细胞在男男性接触人群 HIV-1 早期感染中的作用研究” （JCYJ20150402111430627） ；深圳市科技创新计划“新型艾滋病粘膜疫苗免疫保护机制的研究 ”（JCYJ20140411111718169）作者简介：彭巧丽（1983-） ，女，主治医师，硕士研究生，主要研究方向艾滋病的致病
9、机制通讯作者：王辉，Email：than that of the healthy controls, ART treatment can bring the percentage of gut-homing CD8 cell to nearly normal level, but not the absolute number. The IFN-producing Tc1 showed significant increase (P0.001) in terms of either frequency or absolute number while the percentage the IL
10、-17-producing Tc17 decreases (P0.001) but the absolute number remained stable after HIV-1 infection. ART restored partially the frequencies of gut-homing Tc17 but the increased number of gut-homing Tc1 subset was found not easily reversible. Conclusion As a credible maker for indirect tracking of gu
11、t-homing CD8 cell, peripheral 4+7+RO+CD8+T cell were increased significantly after HIV infection with its functional subpopulation disturbed severely. This suggested that gut-homing CD8+T cell may play an important role in the pathogenesis of HIV. Tracking their change may provide useful bio-markers
12、 for treatment and vaccine efficacy studies. Key words: HIV; AIDS; Gut-homing CD8; Tc1; Tc171. 前言肠道黏膜是外界有菌环境与机体无菌环境的窗口，也是 HIV 病毒入侵机体的主要门户 1, 2。除了导致CD4+T 细胞显著减少外，HIV 感染还可以导致肠道黏膜组织结构和功能破坏、肠道黏膜屏障崩溃，而肠道黏膜屏障完整性的破坏将导致细菌异位进而引起免疫激活，导致疾病进展 3, 4。肠道归巢 T 淋巴细胞通过表达整合素分子 47与肠道配体黏膜地址素细胞粘附分子（mucosal addressin cell a
13、dhesion molecule-1，MAdCAM-1）结合引导至肠道 5, 6，已证实 47通过与 gp120 的 V2 环结合介导 HIV-1 病毒的入侵 7，高表达 47的 CD4 细胞更容易被 HIV 病毒感染 8，早期采用抗体阻断47将有助于减少病毒传播，降低机体病毒载量，延缓病情进展 9, 10，大量研究还证实外周血中 47+T细胞免疫功能的变化可以间接反应肠道 T 细胞的变化 11。课题组前期研究也表明慢性 HIV 感染患者肠道归巢 CD4 细胞显著减少，其功能亚群网络失衡，并不能被有效的抗病毒治疗所重建 12，但对于肠道归巢CD8 细胞及其功能亚群变化目前尚未见报道。2. 对象
14、与方法1.1 研究对象 85 例 HIV 感染患者均为深圳市第三人民医院艾滋病门诊就诊患者，所有患者均经酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA ）初筛及深圳市疾病预防控制中心蛋白印迹试验（Western Blotting，WB）确证 HIV-1 抗体阳性；艾滋病诊断标准符合 2011 年卫生部艾滋病诊疗指南 ，根据抗逆转录病毒治疗（Antiretroviral therapy, ART）与否，将患者分为未治疗组及治疗组两组：未治疗患者 43 例，男性 33 例，女性 10 例，平均年龄 35.6 岁；治疗组患者 42 例，男性 25 例
15、，女性 17 例，平均年龄 38.4 岁，平均治疗时间大于 3 年；同时选取 45 例 HIV-1 抗体阴性的健康体检者为对照，男性 29例，女性 16 例，平均年龄 35.0 岁。所有研究对象均符合深圳市第三人民医院伦理委员会要求，均已签署知情同意书。 （研究对象的一般情况见表 1） 。1.2 实验设备及试剂 流式细胞仪 (FACSCanto) 购自美国 Becton Dickinson 公司，各种单克隆抗体购自 BD Bioscience 公司，包括：CD3CD4CD8 三色单抗、CD3、CD8、 整合素 4、 整合素 7、IFN-、IL-17、CD45RO。OptiLyseC 免洗溶血素
16、及破膜剂购自美国 BD Bioscience 公司。HIV 荧光定量检测试剂盒购买自深圳匹基生物工程公司，PCR 扩增仪为 Roche 公司的 LightCycler。RPMI1640 培养基购自北京海克隆公司，补充 2 mmolL L 一谷氨酰胺、50 mmolL 二巯基乙醇 (2-ME)、1mmol L 丙酮酸钠、50mgL 庆大霉素和 100 mlL 新生小牛血清后为完全培养液。10PBS 由实验室自行配置。1.3 样本采集 用 EDTA 抗凝管采集外周静脉血，并在 4 小时内进行试验。1.4 CD4+T 细胞计数测定：采用 CD45CD4CD8CD3 四色单抗试剂严格按照说明书操作，并
17、采用流式细胞仪检测，软件自动分析 CD4+T 细胞计数。1.5 血浆病毒载量检测：采用实时定量聚合酶链反应（ Real time PCR, RT-PCR）测定，严格按照操作说明进行。1.6 全血胞内细胞因子染色：取新鲜全血 500ul，加入 500ul RPMI1640 完全培养基，分别加入PMA（phorbol 12-myristate 13-acetate） 、离子霉素（inomycin）及阻断剂 BFA（Brefeldin-A ） ，使其终浓度分别为 100ng/ml、1ug/ml、10ug/ml ，置于 37 5%CO2 孵箱中孵育 6h。6h 后取出，吸取上清，加入表面染色抗体 CD
18、3，CD8，CD45RO，整合素 7室温暗置 20min，然后加入 3ml 免洗溶血素，室温避光放置15-20min，1200 转/min 离心 5min，弃上清，以 PBS 5min 洗涤 1 次，再加入破膜剂 800ul 室温避光放置30min，加入破膜洗液 1ml，1200 转/min 离心，加入胞内细胞因子抗体 IL-17 或者 IFN-，室温暗置30min，最后加入 PBS 洗涤 2 次，加入 2%多聚甲醛 150ul，24 小时之内上机检测。表 1. 研究对象的一般情况1 采用 t 检验或卡方检验计算 P 值2 ART 导致 CD4 计数显著上升(P 0.001)3 病毒载量低于检
19、测下限值 (50 copies/ml). 部分数据采用均数 + 标准差表示 ART:抗病毒治疗; NA: 不适用; NS: 无统计学意义1.6 流式细胞仪检测及分析：既往研究已报道4 +7+CD45RO+CD8+T细胞即代表4 +7hiCD8+记忆性T细胞，并证实具有肠道归巢特性 13-15，由于整合素4和7在T细胞上形成二聚体 5,6，并且我们的实验也证实绝大部分7 +RO+CD8+ T细胞（97.5%）都是4 +7+RO+CD8+T细胞，因此本研究7 +CD45RO+CD8+T细胞即代表4 +7hiCD8+ 记忆性T细胞，即肠道归巢CD8细胞。本研究染色后的所有样品均在BD FACSCan
20、to流式细胞仪上进行检测，并采用FACSDiva软件分析。以前向散射角(FSC)和侧向散射角(SSC)圈定淋巴细胞，再以CD3、CD8 圈定CD8 +T细胞,再根据7及CD45RO表达确定肠道归巢CD8细胞即4 +7+CD45RO+CD8+T细胞，进一步分析该细胞群上IFN-及IL-17的表达情况（见图1） 。P-值 1 组别 非 ART 组(n=43) ART 组 (n=42) 健康对照 (n=45) 非 ART 组vs. ART 组非 ART 组 vs.健康对照ART 组 vs. 健康对照年龄（岁） 35.610.1 38.48.4 35.213.5 0.165 0.884 0.258性别
21、 (男/女) 33/10 25/17 29/16 0.208 0.636 0.206111.585.6 (Before)2CD4 计数（个/ul） 208.6100.1 340.5149.7 (After)2 673.9128.3 0.001 0.001 0.001病毒载量（log 10 copies/ml） 4.950.87 1.73 NA 0.001 NS NSCD4 百分比 15.07.1 19.87.8 37.28.8 0.006 0.001 0.001CD8 百分比 50.79.8 41.78.5 22.16.4 0.001 0.001 0.001传播途径血液 1 (2.3) 3 (
22、7.1) NA异性 23 (53.5) 26 (61.9) NA同性 16 (37.2) 8 (19.0) NA静脉注射毒品 3 (7.0) 5 (11.9) NA0.227 NS NSART 时间 NA 41.2 (12-69) NA NS NS NS1.7 统计学分析：所有结果均采用 SPSS119.0 软件进行分析，结果以 Sd 表示，组间比较采用独立样本配对 t 检验或者 Mann-Whitney U 检验或者卡方检验，P0.05 为差异具统计学意义，*代表P0.001，*代表 P0.01，*代表 P0.05。图 1 流式设门策略及典型图Figure 1 The strategy of
23、 FACS analysis and typical picture 2. 结果2.1 HIV 感染后外周血肠道归巢 4 +7 +RO+CD8+T 细胞显著上调整合素 47，表达于 T 细胞表面，通过与肠道配体结合募集循环中的 T 细胞至肠道黏膜。与 HIV感染后肠道归巢 4+7+RO+CD4+T 显著下降不同，HIV 感染后肠道归巢 4+7+RO+CD8+T 细胞表达百分比及绝对值均显著上升 (P=0.000)，健康对照组为 5.53+2.66%及 24.59+9.48，未 ART 组为 14.74+7.74%及96.19+68.92，经过抗病毒治疗后，虽然 4+7+RO+CD8+ T 细胞
24、百分比可部分下降至 6.91+5.37%，与健康对照相比差异无统计学意义，但 4+7+RO+CD8+ T 细胞绝对值仍高于正常水平，差异具统计学意义（49.35+44.23 vs 24.59+ 9.48，P=0.000） 。0204060*%4+7+RO+CD8+T celsHDNo ART ART*050101502025030*Absolute4+7+RO+CD8+TcelsHDNo ARTART图 2 抗病毒治疗前后外周血肠道归巢 4 +7 +RO+CD8+ T 细胞表达比较Figure 2 The expression of gut-homing 4 +7 +RO+CD8+T befo
25、re and after ART2.2 HIV 感染后外周血肠道归巢 4 +7 +RO+CD8+T 细胞分泌 IFN- 水平上调接着，我们又检测了分泌 IFN- 的肠道归巢 4+7+RO+CD8+T 细胞的表达水平，以下简称 4+7+RO+ Tc1，结果发现，未 ART 组患者 4+7+RO+ Tc1 的百分比及绝对值均显著增高，分别为（86.48+12.59% vs 73.66+14.60%，P=0.000；91.50+ 65.97 vs 20.97+9.73，P=0.000 ） ，经过抗病毒治疗后，4 +7+RO+ Tc1 百分比及绝对值均显著下降，但仍明显高于健康人（82.59+13.0
26、3% vs 73.66+14.60%，P=0.000；40.51+65.97 vs 37.00+9.73，P=0.000） ，差异具统计学意义。图 3 ART 治疗前后 4 +7 +RO+ Tc1 细胞表达比较02040608010 *HDNo ART ART%+7+RO+Tc 010203040*HDNo ART ARTAbsolute4+7+RO+Tc1 celsFigure 3 The expression of4 +7 +RO+ Tc1 before and after ART2.3 HIV 感染后外周血肠道归巢 4 +7 +RO+CD8+T 细胞分泌 IL-17 水平下调分泌 IL-
27、17 的 CD8 细胞，也叫做 Tc17,与 Th17 相对应，通过对肠道归巢 CD8 细胞的另一功能亚群Tc17 检测发现， HIV 感染使得肠道归巢的 4+7+RO+Tc17 细胞百分比显著减少（ 1.08+1.59% vs4.51+3.41%，P=0.000） ，经过 ART 治疗，该功能亚群细胞可显著增高，与健康对照相比无显著差异（2.99+2.28 vs 4.51+ 3.41%, P=0.0916） ；而 HIV 感染对 4+7+RO+Tc17 绝对值则无显著影响。图 4 ART 治疗前后 4 +7 +RO+ Tc17 胞表达比较Figure 4 The expression of4
28、 +7 +RO+ Tc17 before and after ART4. 讨论整合素 7可以与 4及 E结合形成异二聚体 47和 E7，前者引导细胞归巢至肠固有层，后者则引导细胞归巢至肠上皮，由于后者很少表达在外周血，因而外周血中 47细胞即代表肠道归巢细胞 11,16,17。Arthos 等人研究发现 HIV-1 gp120 蛋白的 V2 环含有一段包含 3 个氨基酸的保守序列，该序列与 47的天然配体核心序列极其相似，因而可以介导 gp120 与 47的直接相互作用，并且该研究还发现采用氨基酸置换和封闭 gp120 蛋白的方法可以阻断这种相互作用 7；Francois Villinger
29、等 9在 SIV 急性感染动物模型的体内试验中发现，采用抗 47单克隆抗体阻断整合素 47，可以显著降低病毒载量延缓病程进展，进一步佐证了 47在 SIV/HIV 感染发病机制中的重要作用。Lu 等 18人对 HIV 感染急性期 MSM 人群研究发现，在感染早期肠道归巢 47CD4+T 细胞及出现显著受损，本课题组早期对慢性 HIV 感染患者研究发现，HIV 感染将导致外周血肠道归巢 47CD4+T 细胞显著减少，其功能亚群网络失衡，并与疾病进展相关，长期抗病毒治疗不能恢复其数量及功能 12。既往大量研究已报道 HIV 感染使得 CD8 细胞大量活化增殖，且影响 CD8 细胞许多亚群，除了 H
30、IV特异性 CD8 细胞，还有其他分化类型不同的 CD8 细胞 19，20，21 。本研究发现，慢性期 HIV 感染患者外周051015* *HDNo ART ART %4+7+RO+Tc7 0246810HDNo ART ARTAbsolute4+7+RO+Tc17 cels血中肠道归巢 47CD8+T 细胞比例及数量显著增加，且有效抗病毒治疗并不能使其恢复正常，外周血中减少的 47CD4+T 与增加的 47CD8+T 细胞导致肠道归巢的 CD4：CD8 比例倒置，与外周血总的 CD4及 CD8 细胞变化趋势一致 22。既往肠道活检染色已证实在 HIV 感染过程中的肠道 CD8 细胞是大量聚
31、集的，原因可能与在免疫激活及各类抗原的刺激下该细胞群高度增殖有关，且研究还报道外周血活化 CD8细胞表面肠道归巢受体 7 水平显著增高，与细菌异位及免疫激活相关，与本研究结论一致 23。提示外周血肠道归巢 CD8 细胞的变化可以作为追踪 HIV 感染后肠道 CD8 细胞变化的一个替代指标。CD8 细胞也存在分泌不同细胞因子的功能亚群，与 Th1 及 Th17 相对应，分别称为 Tc1 及 Tc17，在体外培养的细胞因子极化条件下可以诱导分化 24，25 。作为最经典的辅助性 T 细胞，产生 IFN- 的 Th1 及Tc1 在抗细菌、抗真菌及 HIV 感染的细胞免疫反应中起重要作用。而 Tc17
32、,主要分泌 IL-17，在保持黏膜完整性及抗细菌免疫中发挥重要作用 26，近期研究发现，HIV/SIV 感染后 Tc17 在早期即受损，并不易被恢复 27，同时在非致病性的 SIV 感染（非洲白眉猴）中 Tc17 并未减少，提示 Tc17 在早期 HIV 感染中起保护作用 28。本研究通过对分泌 IFN- 及 IL-17 的肠道归巢 CD8 细胞功能亚群研究，发现机体感染 HIV后肠道归巢 Tc17 细胞显著减少，而 Tc1 却显著增加，这与之前的报道是一致的 29,30,31。有研究报道，CD3+CD8+CD161high , CD8+CD90+及 CD161+MAIL 细胞由于可以产生 I
33、L-17，故近似被认为 Tc17，大部分这类细胞都表达肠道归巢分子 47，具有肠道黏膜归巢特性 29,30,31,32，本研究则直接采用 47标记肠道归巢 CD8 细胞，对于肠道归巢 CD8 细胞及其亚型的研究更精确。现已证实，Tc1 作为效应分子，可以产生 IFN- 并有效杀死靶细胞，其在 HIV 感染后大量增加可能与肠道外源性抗炎的不断刺激有关 28；Tc17 细胞缺乏体外溶解功能，在控制黏膜表面胞外菌及肠道环境自稳中起重要作用，对其表型分析显示该细胞群高表达协同抑制分子 CTLA-4，CTLA-4 可以与表达于抗原呈递细胞如树突状细胞的 CD86 及CD80 结合，从而发挥抑制 T 细胞
34、的活化功能，此外，Tc17 细胞中多功能细胞的比例较 Tc1 更高，而表达颗粒酶 B 则较少，所有这些特点提示 Tc17 发挥更多的调节功能而不是细胞毒功能，而这将有助于调节过度的由肠道免疫激活引起的 Tc1 反应 28。因此我们推测，肠道归巢 Tc17 细胞的减少将增强机体免疫激活，从而导致过度的 Tc1 反应，进而导致网络失衡，影响疾病进展。尽管 HIV 病毒直接感染 CD8 细胞已有报道 33，但本研究中并未发现病毒载量与 Tc17 之间存在相关性，这就提示病毒本身可能不是影响该细胞亚群减少的主要原因，体外实验也表明 HIV 病毒并不直接感染 CD161+/MAIT（主要为 Tc17）
35、27，此外，在非致病性自然宿主仍保留较高病毒载量却并不出现 Tc17缺失也提示病毒本身不是导致其减少的主因 28，这些结果都与本研究结果相吻合。综上所述，外周血肠道归巢 4+7+RO+CD8+T 细胞作为可以间接反应肠道 CD8 细胞变化的可靠指标，在 HIV 感染后显著增高，而其功能亚群则出现平衡紊乱，在 HIV 致病机制中可能起重要作用，对其变化特点的追踪可能为疗效监测及疫苗研究提供重要的依据。5. 参考文献1 Brenchley JM, Schacker TW, Ruff LE, et al. CD4+ T cell depletion during all stages of HIV
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