1、疟原虫镜检技术制片与染色,主要内容,厚薄血膜的制作与染色。疟原虫计数方法。,血膜的制作（所需设备）,载玻片：新玻片浸入有液态洗涤剂的清水中10-20分钟，干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干，最后用干净柔软的棉巾将玻片擦亮。已用过的玻片浸泡于洗涤剂溶液中1-2天，或浸泡于煮沸的5%肥皂水中1-2小时，再放入新配置的洗涤剂溶液中1-2小时，逐个擦去血膜痕迹，清水漂洗干净，擦亮。采血针：一次性玻片盒：防止污染和昆虫吸食血膜75%酒精棉球：采血前后消毒记号笔：玻片上书写号码,血膜的制作（取血时间）,现症病人和流调普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。疟
2、疾典型的临床表现分前驱期、发冷（寒战）期、发热期、出汗期和间歇期五期。 间日疟在前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低，镜检多为阴性。发冷（寒战）期相当于红内期成熟裂殖体涨破红细胞期，镜检多为裂殖体和环状体。发热期，外周血中以环状体（小滋养体）为主，也可见到裂殖体；出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性。发作后数小时，间歇期外周血中以大滋养体为主，形态较易辩认，为诊断的有利时机；发作36-48h，可检出裂殖体；发作1-2次后，配子体出现较多。恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20h内取血，发作后2小时左右，此时环状体发育至最高峰，初发患者退热后常查不到原虫。末梢血血检到恶性疟原虫配子体，是在
3、末梢血出现环状体之后的7-10天。,血膜的制作（取血操作）,在采集标本、制作血片前，首先要核对患者的姓名、年龄和住址。,取血部位和方法,耳垂或无名指（婴幼儿拇趾或足跟），通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅（12mm为宜）。然后用左手大拇指、食指和右手中指协同轻轻挤压出血滴。,用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂成薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘状，称厚血膜。最好一张玻片上同时制作厚、薄两种血膜。,涂制厚、薄血膜的位置 作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个。方法是将载片分为
4、6等分，第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。门诊和发热病人血片每片1人，涂2个厚血膜1个薄血膜，以防血膜脱落而影响检查。,标本片,发热病人血片,标签,厚血膜的制作,取洁净的载玻片1张，左手持载玻片平置,右手持推片，用推片的一角，从取血部位刮取约45微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径0.81cm大小圆形厚血膜。位置，位于玻片右1/3处（中央偏右或6等份中的与贴标签的1、2份相邻的第3份中部）。外观，圆形厚薄均匀，边缘整齐。过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求，以1个油镜视野5-10个白
5、细胞为宜。,薄血膜的制作,用推片一端边缘的中点从取血部位刮取约11.5微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片中线接触，并形成25350夹角，待血液向两侧扩展约 2cm2.5cm宽时，均匀而迅速地从右向左推成舌状薄血膜（约2.5cm长）。注意：推制时速度要均匀，血滴大小、推片与载玻片之间夹角大小及展开血膜的速度快慢等常影响血膜的厚薄。也可载玻片平置在桌面上操作。位置，位于玻片左半部分或第4格前缘到第6格中部 ；外观，舌状厚薄均匀，无划痕；应在玻片上形成平铺的红细胞，红细胞之间互相接触而不相互重叠。,正确的推片姿势,标准的疟疾厚薄血膜位置,血膜的编号,血膜制成后，立即在玻片面上
6、贴标签或写上受检者的号码，以防差错；待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。,制作血膜注意事项,清洗玻片，且勿碰撞、磨损 载玻片必须完全清洁无油渍或污垢。制片时，手指勿接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。刚涂制的血膜要平放在标本盒内 厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘，防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜；干后应及时装入标本盒并盖严。血膜应自然干燥 切忌在毒太阳下晒或火烤，加快其干燥可采用手背上
7、或衣服摩擦、风吹，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能24-48h内固定染色；冬天也不能超过72h。放置时间越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定（13分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干后装入盒内盖严，待以后染色。,染液的种类,疟原虫的染色，目前临床上应用最广泛的是瑞氏（Wright stain）和姬氏染液（Giemsa stain）。这些染液中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝氧化所成的天青，所以称多色性染剂。我们主要用姬氏染液，它具有方便，染色效果稳定，便于长期保存的优点。瑞氏染色，染色时间短，但染色效果不如姬氏稳定，主要在门诊量大的门诊实验室
8、使用。,染液的染色原理,是染料与被染物的阴阳离子互相吸附而结合的一种化学反应。红、白细胞和疟原虫所含蛋白质的氨基酸电离出的阴阳离子与酸碱染料伊红、美蓝有色集团所带的阴阳离子相互结合便被染上不同的颜色。疟原虫和白细胞的胞浆被染成蓝色，红细胞、疟原虫和白细胞核被染成紫红色。 红、白细胞和疟原虫的蛋白质均由氨基酸组成，每个氨基酸电离出一个带正电荷的-NH3+和一个带负电荷的-COO-。多色染剂的碱性染料美蓝的有色基团带阳离子，可与细胞中带负电荷的-COO-部分结合，使之成为蓝色。疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质，故被染成蓝色。酸性染料伊红的有色基团带阴离子，可与细胞中带
9、正电荷的-NH2+部分结合，使之呈红色；但美蓝与伊红都不能使疟原虫和白细胞的核着色，可美蓝氧化后产生的天青有媒染作用，于是，在媒染物与染料的共同作用下，疟原虫和白细胞核被染成紫红色。,注意：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求染液的pH值7.0-7.2较好。染液偏酸时，所带的正电荷增加，易于伊红结合，使红细胞和疟原虫的核染成鲜红色，而淋巴细胞和原虫的胞浆着色较差；反之，当染液偏碱时，红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫蓝色，不易观察。,姬氏染液母液配置方法,材料： 1、姬氏粉5克 2、甘油250ml 3、甲醇250ml将姬氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，边加边磨，至甘油加完为止，倒入500
10、ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶中，再次加甲醇洗后倒入瓶中，至洗净研钵为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，置于5560水浴中或温箱内24h或室温内35天，每天用力摇动5分钟，即成原液。配制1-2周后可以使用。姬氏染液是目前较优良的血膜染剂，能长期保存而不变质。 注意事项： 1.高纯度试剂。 2.所用器皿绝对无水（伊红在水溶液内遇到美蓝或天青即可互相结合而产生沉淀，从而失去染色力）。 3.边加边磨，充分研磨；整个染色液配制时间不能少于5个小时。,姬氏染液的染色方法,血片干燥后,先用甲醇或无水酒精固定薄血膜（瑞氏不需固定）,再用清水对厚血膜溶脱血红蛋白(新制作的也可直接染色)，然
11、后再进行染色。 注意：吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果。成批血片染色：将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%姬氏染液稀释液（3毫升姬氏原液加缓冲液或蒸馏水97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30-40min（根据当地实际情况，酌情增减染色时间），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。单张血片染色：将处理好的血膜，加姬氏母液2-3滴，加缓冲液或蒸馏水1ml，混合均匀，染色15-20分钟左右，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。（勿直接倾倒掉玻片上的染液，防止渣滓附着在玻片上冲不掉影响镜检）较理想的染色结果
12、是红细胞为淡红或淡紫红色，疟原虫的胞质呈蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。,快染 配制8-10%染液(每张血片约需染液2ml):量筒内量2ml缓冲液或新鲜凉开水，直接滴加姬氏原液4-5滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10-15min，清水细缓冲洗，晾干镜检。慢染 配制3%染液:在染色量筒内量2ml蒸馏水或新鲜凉开水，再滴加姬氏原液2滴，混匀，滴入待染标本上，染色3040min。清水细缓冲洗，晾干镜检。,姬氏染液浓度,门诊染色,血片制作染色评估考核标准,影响染色效果的因素,血片染色好坏除与玻片清洁度、血片制作质量和染色技术等有关外，还受到以下因素的影响： （1）染剂、溶剂的质量 染料、甲
13、醇和甘油必须用分析纯，且在配制时所用的器具必须干净且无水份。（2）染液的新旧 染液存放时间越久，染色力越强。新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。通常在染液配制12周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密，以防吸潮而影响染液质量。（3）染液稀释后使用时间 必须现用现稀释染液，当时使用，一般在0.5h内染色力最强。 姬氏和瑞氏染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在甲醇中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。,影响染色效果的因素,（4）染液的稀释浓度 染液的浓度高，着色就快而深，疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度过低则染色时间久，
14、颜色偏酸，薛氏点不明显或消失。（5）染色时间 染色时间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。（6）染色用水 染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择pH7.0-7.2缓冲液（Na2HPO4,KH2PO4），也可以使用新鲜的蒸馏水或过滤的冷开水。在现场无上述条件时也可用井水、河水、泉水或雨水。（7）冲洗方法 应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒附着于血膜。,血片染色注意事项,配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量。 固定薄血膜时勿将甲醇触碰到厚血膜。 冲洗染液
15、时，水流轻缓，勿冲走厚血膜。,原虫密度计算,估计疟原虫感染程度有三种方法：半定量计数法 检查厚血膜白细胞原虫密度计数法检查厚血膜红细胞感染率计算法检查薄血膜白细胞疟原虫密度计数法（WHO推荐）用于疟疾研究用于临床诊断用于抗疟后疟疾考核,用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。国内常用。此方法将密度分为6级：全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少”平均每个视野15个虫，记录“”平均每个视野610个虫，记录“+” 平均每个视
16、野11100个虫，记录“+ ” 平均每个视野100个虫以上，记录“+ ”,半定量计数法,在厚血膜，按要求选择视野，计数200个白细胞，同时计数观察到的疟原虫数，如果原虫密度较低，可增加白细胞计数（500 1 000 个）。白细胞疟原虫计算公式： 疟原虫数 计数的白细胞数 患者每微升血的白细胞数 = 疟原虫数/l血。如果不知患者的白细胞数，则每微升血以 8000个白细胞计算(国际标准) ，国内按6000个白细胞计算。,白细胞疟原虫密度计数法,白细胞疟原虫计数法举例,假设计数200 WBC的同时，计数了40个疟原虫，在不知患者白细胞数的情况下，以每微升血8 000个白细胞为数, 由此计算出每微升血
17、液疟原虫密度为：,40（原虫数） 200（白细胞数）x 8000=1600 / l血,从血膜的左上角开始，横向。计数1个视野后间隔5个视野再计数。适用于疟原虫密度较高时。在1个视野中，有时会重复计数。先把视野分成4个象限，从右上象限起顺时针方向计数整个视野。,计数方法,薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查一个角落，应顺玻片的横轴检查。镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫，不要笼统地记作混合感染。,红细胞感染率计算法（薄血膜）,疟原虫密度=红细胞原虫感染率X红细胞数/微升血红细胞原虫感染率（%）= 疟原虫数 计数的红细胞数X 100 % 涂制薄血膜的同时，计数每微升血液中红细胞数，也可按男性500万个/微升血、女性450万个/微升血计算。疟原虫密度较高时，检查1000个红细胞即可，密度低时，可按公式N=45.5 X （IP）P计算需要检查的红细胞数。N为需要检查的红细胞数， P为1万个红细胞中的疟原虫数，I为血样单位（以1万个红细胞计算），45.5为常数。,谢谢！,
