1、 毕 业 设 计（论 文）题 目：荧光分光光度法评价环肽类天然植物提取物对血管紧张素酶的抑制作用姓 名： 学 号： 所在学院： 食品与制药工程学院 专业班级： 制药工程 指导教师： 日 期： 毕业设计（论文）专用纸I摘 要人工合成的降血压药物如卡托普利(captopril)，西拉普利(cilazapril)，依那普利(enalapril)，赖诺普利 (1isinopri)等药物的临床应用表明，抑制血管紧张素转化酶 (ACE)活性能有效地降低血压，但长期使用，耐受性差，常见不良反应，限制了临床使用。中药来源于天然动植物，资源丰富，筛选能有效抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性的中药具有重要的现实意
2、义。目的：本实验采用荧光分光光度法，研究天然植物提取物L5、L6、LA、LB 对血管紧张素酶的抑制效果，旨在为开发降血压中药提供科学依据。方法：实验采用体外模型，用 96 孔板代替传统的比色皿，以马尿酰一组氨酰一亮氨酸(Hippuryl-Lhistidyl-Lleucine，HHL)为 ACE 反应底物，产物马尿酸 (Hippufic acid，HA)为测定指标，卡托普利为阳性对照，通过检测加入前后物质荧光强度的差异，计算该物质对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制率，评价 L5、L6 、LA、LB 对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制作用。结论：试验探究的浓度为 10-3M、10 -7M 天然植物
3、提取物L5、L6、LA、LB 对血管紧张素转化酶 (ACE)有抑制效果。关键词：血管紧张素酶；血管紧张素酶抑制剂；荧光分光光度法；酶活性毕业设计（论文）专用纸IIAbstractClinical application of synthetic blood pressure lowering drugs such as captopril , cilazapril , enalapril , lisinopril and other drugs indicated that inhibition of angiotensin-converting enzyme (ACE) activity c
4、ould effectively lower blood pressure, but long-term use can cause poor tolerance, common adverse reactions, limiting the clinical use.Chinese medicine is derived from natural flora and fauna, rich in resources, screening Chinese medicine which can effectively inhibit angiotensin converting enzyme (
5、ACE) activity has important practical significance. Objectives:By fluorescence spectrophotometry, study on the angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of natural plant extracts L5, L6, LA, LB effect, designed to provide a scientific basis for the development of blood pressure medicine. Met
6、hods:In this study, the vitro experimental model and fluorescence spectrophotometry were used.In addition,instead of the traditional cuvette 96-well plates were used.When the Hippuryl-L-histidyl-L-leucine reacted with ACE, Hippufic acid was producted as the indicators for the determination.Captopril
7、 as a positive control,by detecting the fluorescence intensity difference before and after .Calculate inhibition rate and evaluate the inhibition of L5, L6, LA, LB .Conclusions: Natural plant extracts L5, L6, LA, LB can exert inhibitory effect on angiotensin converting enzyme (ACE) at the concentrat
8、ion of 10-3M and 10-7M.Keywords：angiotensin-converting enzyme；angiotensin-converting enzyme inhibitors；fluorescence spectrophotometry；activity毕业设计（论文）专用纸III目 录摘 要 .IAbstract.II目 录 .III一 引 言 .11.1 血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶抑制剂 .11.1.1 肾素-血管紧张素系统及血管紧张素酶的概述 .11.1.2 血管紧张素转化酶的调血压机理 .21.2 酶活性 .31.2.1 酶活力的影响因素 .31.
9、2.2 酶活性和质量测定方法及其评价 .41.2.3 ACEI 活性的评价方法 .51.3 天然血管紧张素转化酶抑制剂的研究进展 .51.4 荧光分光光度计 .61.4.1 仪器原理 .61.4.2 影响荧光强度测定的因素 .7二 实 验 .82.1 实验材料与仪器 .82.1.1 实验仪器 .82.1.2 实验材料 .82.1.3 实验溶液 .92.2 实验方法 .102.3 实验操作 .112.3.1 ACE/HHL 背景检测、ACE 酶活检测 .112.3.2 卡托普利抑制效率测定 .112.3.3 样品（L5、L6、LA、LB）抑制活性测定 .12三 结果与讨论 .13毕业设计（论文）
10、专用纸IV3.1 酶活性对荧光特性物质生成的影响 .133.2 卡托普利对 ACE 的抑制活性结果测定 .143.2.1 不同浓度的卡托普利对 ACE 的抑制活性测定 .143.2.2 10-3M 卡托普利对 ACE 的抑制活性测定 .153.2.3 10-7M 卡托普利对 ACE 的抑制活性测定 .173.3 样品对 ACE 的抑制活性结果测定 .173.3.1 L5、L6（10 -3M）对 ACE 的抑制活性测定 .173.3.2 L5、L6（10 -7M）对 ACE 的抑制活性测定 .193.3.3 LA、LB（10 -7M）对 ACE 的抑制活性测定 .213.4 反应时间对抑制效果的
11、影响 .233.5 反应体系物质对抑制效果的影响 .233.6 反应体系中抑制剂浓度的确定 .23四 结论与展望 .25致 谢 .26参考文献 .27毕业设计（论文）专用纸1一 引 言高血压是一种常见的心血管疾病，它不仅患病率高，而且常引起严重的心、脑、肾等其他疾病，是脑卒中、冠心病、心力衰竭和肾脏疾病主要危险因素 1。高血压是现代社会严重威胁人类健康的“头号杀手” 。2010 年，中国高血压患者已超过 2 亿，每年还在以l 千万人的速度继续增加 2。因此，研究生产高效安全的降血压药物已经成为国内外科学家积极探索的一项重要课题。目前，临床治疗上主要采用合成类降血压药物，如人工合成的降血压药物如
12、卡托普利(captopril)，西拉普利(cilazapril)，依那普利(enalapril)，赖诺普利(1isinopri)等药物的临床应用表明，其疗效虽好，但长期使用，耐受性差副作用较大，如引起降压过度、泌尿系统病变、持续性咳嗽、味觉失真和血管神经性水肿等 3,4,5,6。自1965 年 Ferreira 从南美蝮蛇毒液中发现天然 ACE 抑制剂以来，很多研究者在寻找天然ACE 抑制剂方面进行了大量探索。近十多年来，我国在这方面的研究逐渐活跃并开始深入 7。人们试图从自然界中找寻天然的 ACE 活性抑制剂。中药来源于天然动植物，资源丰富 8，筛选能有效抑制 ACE 活性的中药具有重要的现
13、实意义。1.1 血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶抑制剂1.1.1 肾素-血管紧张素系统及血管紧张素酶的概述肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，简称为 RAS）或肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system,简称为 RAAS）是一个激素系统。当大量失血或血压下降时，这个系统会被启动，用以协助调节体内的长期血压与细胞外液量（体液平衡） 。血管紧张素转化酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）是一种二价二肽羧基金属肽酶 9，在肾素-血管紧张素（RAS）系统中起着重要作用。当血
14、压降低时，肾脏分泌肾素。肾素催化血管紧张素原水解产生血管紧张素 I。血管紧张素 I 基本没有生物学活性，而是经血管紧张素转化酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）剪切 C-末端两个氨基酸残基而形成血管紧张素 II。血管紧张素 II 具有高效的收缩血管作用，从而使血压升高；血管紧张素 II 也能刺激肾上腺皮质分泌醛固酮。醛固酮能促进肾脏对水和钠离子的重吸收，继而增加体液容量，升高血压。过度激活的肾素-血管紧张素-醛固酮系统是产生高血压的原因之一。下面几类药物毕业设计（论文）专用纸2可用于抑制肾素-血管紧张素系统：血管紧张素转化酶抑制剂；血管紧张素 II 受体拮抗剂
15、；肾素抑制剂。血管紧张素转化酶因催化血管紧张素 I 转化为血管紧张素 II 和使具有舒张血管或降低血压作用的舒缓激肽（BK，bradykinin)失活这两种功能而成为治疗高血压、心力衰竭、2 型糖尿病和糖尿病肾病等疾病的理想靶点。血管紧张素转化酶抑制剂能减少血管紧张素II 的生成，并增加缓激肽的活性。1.1.2 血管紧张素转化酶的调血压机理血管紧张素转化酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）广泛存在于肺、肾、脑、眼球、小肠、胎盘等组织的血管内皮细胞或上皮细胞及血浆、尿等体液中 10。该酶由一条多肽链构成，N 末端为苏氨酸，C 末端为丙氨酸，需要阴离子激活，其中
16、Cl-为最有效的激活剂，等电点在 4.5 左右 11,12，人肺组织和血清中 ACE 分子量为 140,000-150,00013。杨严俊等从兔肺提取 ACE 并进行特异性研究表明，酶活随温度升高而上升，至 37达到最大，超过则开始下降。在 37时，反应体系 pH 在 7-9 稳定性最高，其中最适 pH 为8.314。该酶具有广泛的底物专一性，除作用于血管紧张素 I 外，还与含不同 C 末端氨基酸的肽底物起反应，如舒缓激肽、脑啡肽、P 物质等 10，能被金属螯合剂、重金属盐和特定肽类所抑制。ACE 在人体肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，简称为 RAS）和
17、激肽释放酶-激肽系统（Kallikerin-kinin system,简称为 KKS）中，对血压调节起着重要作用，见图 1-1。 RAS 和 KKS 是一对血压调节方面相互拮抗的体系，二者平衡才能维持血压正常。在 RAS 系统中，肾素能水解血管紧张素原释放出血管紧张素 I，经 ACE 作用去掉其末端的二肽(Histidyl-Lleucine，His-Leu)生成血管紧张素 II，它作用于血管壁上的受体使周围小动脉、血管平滑肌收缩，同时刺激醛固酮分泌，促进人体肾脏对 Na+、K +的重吸收，引起钠储量和血容量的增加，从而导致血压升高。在 KKS 系统中，一些激肽如舒缓激肽能扩张毛细血管，增加其通
18、透性，使血压下降。而 ACE 在该系统中能使舒缓激肽失去 C末端的 Phe-Arg 或 Ser-Pro，从而使激肽失活，引起血压升高 7,10,11。由此可见，ACE 活力升高则破坏了两个系统的平衡，使血压升高。因此，抑制 ACE 活性对降血压有着关键作用。血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)对实验性高血压动物及高血压患者有明显降压作用。在降压时不引起反射性心率增快，不出现水钠潴留现象，也不易产生耐药性。不同作用强度的 ACEI，因其药物结构及药代动力学方面存在差异，在降压作用出现的快慢、作用维持的时间上可呈现不同。研究表明，ACEI 的降压作用机制其一是，抑制循环及局部组织中的 ACE。由于抑
19、制循环中的 ACE，血浆中血管紧张素 II 和醛固酮浓度降低，从而使血管扩张血容量降低，这是用药初期外周阻力降低、血压下降的主要原因。ACEI 对局部组织（血管壁、脑、肾毕业设计（论文）专用纸3等）中的 ACE 也有抑制作用，且与局部组织中的 ACE 结合较持久，对酶的抑制作用也较长，这与 ACEI 的长期降压作用有关。图 1-1 ACE 在血压调控系统中的作用1.2 酶活性1.2.1 酶活力的影响因素1.2.1.1 pH 值大部分酶的活力受其环境 pH 值的影响，在一定 pH 值下，酶促反应有最大速率，高于或低于此值，反应速率都会下降，通常称此 pH 值为酶促反应的最适 pH 值。强酸强碱会
20、影响酶蛋白的构象，甚至使酶变性而失活。当 pH 值改变不很强烈时，酶虽然不变性，但活力会受影响。pH 值影响分子中其他一些基团的解离，这些基团的离子化状态与酶的专一性及酶分子中活力中心的构象有关。1.2.1.2 温度每一种酶都有一个最适温度，即使酶发挥最大催化效应的温度。酶的最适温度不是特征物理常数，而与酶的作用时间、酶浓度、底物、酶活剂和抑制剂等因素有关。最适温度会随作用时间的改变而改变，作用时间长，酶的最适温度就低；作用时间短，酶的毕业设计（论文）专用纸4最适温度较高。1.2.1.3 激活剂凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂，其中大部分是离子或小分子有机化合物。（1）金属离子。金属离子对酶
21、的作用有两种，一是作为酶的辅因子起作用，二是作为激活剂起作用。作为激活剂起作用的有 K+、Na+、Mg 2+、Zn 2+、Fe 2+和 Ca2+等，其中Mg2+是多种激酶和合成酶的激活剂。（2）阴离子。在一般浓度下，阴离子的激活作用并不明显。Cl -、Br -有激活作用，但Br-激活作用比较弱。1.2.1.4 抑制剂酶在不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性降低或丧失，成为抑制作用（inhibition） 。能引起这种抑制作用的物质称为酶的抑制剂（inhibitor） 。研究抑制剂对酶的作用是非常重要的，很多药物是酶的抑制剂，通过对病原体内某些酶的抑制作用或改变体内
22、某些酶的活性而发挥其治疗功效，了解酶的抑制作用是阐明药物作用机制和设计研究新药的重要途径。1.2.2 酶活性和质量测定方法及其评价1.2.2.1 酶活性测定方法（1）按反应时间分类法：定时法：通过测定酶反应开始后某一时间段内（t 1 到 t2）产物或底物浓度的总变化量来求酶反应初速度的方法，称为两点法（其中 t1 往往取反应开始的时间） 。在酶反应一定时间后，通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，使反应完全停止，所以也叫中止反应法。连续监测法：又称为动力学法或速率法、连续反应法。在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。平衡法：通过测定酶反
23、应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。（2）按监测方法分类：分光光度法；旋光法；荧光法；电化学方法；化学反应法；核素测定法；量热法。毕业设计（论文）专用纸51.2.2.2 酶质量测定法：随着免疫技术的发展，出现了利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，直接用质量单位（ng/ml、g/L）来表示酶含量的高低，所得结果的诊断价值高。用免疫学方法比测定酶活性方法的优点是灵敏度和特异性高，且不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响，当血液中有酶抑制剂存在，或因基因缺陷，合成了无活性的酶蛋白时，可以测出灭活的酶蛋白量，有利于疾病诊断和科学研
24、究。1.2.3 ACEI 活性的评价方法 ACEI 的评价方法主要有体内试验和体外检测两种。体外检测法目前大都采用Cushman15等建立的方法或做相应修改。其主要原理是 ACE 在 pH8.3、37及 Cl-激发条件下，能水解马尿酰组氨酰亮氨酸(Hippuryl-Lhistidyl-Lleucine，简称为 HHL)产生马尿酸(Hippufic acid，HA)，该物质在 288nm 处有最大光吸收，产生马尿酸的量与 ACE 活性成正比。测定时，在 ACE 和 HHL 反应体系中加入抑制剂，以未加抑制剂的为对照，反应结束后用乙酸乙酯分别萃取出各体系中的马尿酸，蒸干乙酸乙酯并用水溶解后在288
25、nm 下测吸光值，将两者吸光值的差值与对照系的吸光值相比，计算出抑制率，作为ACE 抑制剂的活性 16,17。体内试验主要是动物实验和临床实验。动物实验一般以自发性高血压鼠(Sponianeously Hypertensive Rat，简称 SHR)为研究对象，通过饲喂或静脉注射 ACE 抑制剂，测量试验前后 SHR 的血压变化来衡量抑制活性的大小 18。根据饲喂次数，可将实验分为短期实验和长期实验。短期试验只测一次性口服 ACEI 前后的血压变化;长期实验是每天饲喂一次或每周一次连续几周甚至十几周，连续观察 SHR 的收缩压变化。临床实验主要通过选择若千位临界高血压患者和轻微高血压患者，连续
26、测量各人血压得到平均值作为基本值。而后随机分成两组，一组每日食用一定剂量的 ACEI，另一组作对照，测两组患者血压变化差异进行酪蛋白源血管紧张素转换酶抑制肤制备及分离纯化研究统计分析 19。一般来说，体外检测法方便、快捷，条件较易达到，稳定性也较好，已经成为国内外研究者主要采用的方法。但在生物体中，ACE 抑制肤的抑制效果可能跟体外检测结果相差较大。这是因为 ACE 抑制剂摄入体内，经蛋白酶水解后可能变成降血压活性更高的片段，也有可能被水解成降血压活性较低或几乎没有活性的片段 20。因此，测定 ACE 抑制剂活性可以采用体外检测和体内试验，但要得到降血压的实际效果，必须进行体内试验检测。由于体内试验方法条件要求较高，实验操作繁琐，且饲喂周期较长，给检测带来诸多不便，目前一般在前期研究中多以体外检测为主，在产品研发后期才采用体内试验。
