1、高通量测序技术在肿瘤诊断与个体化治疗中的应用,吴晨,肿瘤是一种基因病,基因过表达与突变,同病异突变,传统突变检测的局限性,NGS,测序的历史,高通量测序:一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，又称为下一代测序技术，其使得可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。 High-throughput Sequencing Next Generation Sequencing Deep Sequencing,高通量测序简介（NGS）,文库扩增,低通量,Sanger测序 高通量测序,并行测序高通量,无需建立文库，两端加测序接头,PCR扩增,a: Roche/4
2、54, Life/APG, Polonatorb: Illumina/Solexa Solid-Phase amplificationc: Applied Biosystems SOLiD systemd: Helicos Biosciences: one pass,454 测序流程,Illumina Solexa 测序流程,ABI SOLiD测序原理,三种平台的技术差异,1.对于研究区域比较严格定义的时候，Agilent平台更适合。 2.Illumina平台能够捕获UTR区域，其他平台不行。 3.Agilent能检测到最多的SNP及插入缺失。,科研应用（潜在临床应用前景）,外显子组测序,Ex
3、ome Sequencing Allows for Rapid Gene Identification in a Charcot-Marie-Tooth Family Annual Neurology冰桶挑战让我们进一步认识了进行性神经性肌萎缩综合征。全外显子测序分析了这一罕见家系存在的基因突变类型 （罕见病家系）,10 HBV（+） HCC with PVTTs and matched controls,Illumina/Solexa sequencing ABI SOLiD sequencing,Identification of candidate somatic mutations.,
4、Identification of somatic indels,PCR-based Sanger resequencing.,基因组DNA打断,外显子捕获富集,文库建立,测序,原始数据下机,数据过滤质控,Shooting Gun,参考序列,无,有,Indel, SNP 统计氨基酸突变研究GO功能分析KEGG通路分析,测序深度评估测序覆盖度评估测序随机性评估,分析内容,测序评估,外显子组测序,Wei X,Walia V,et al. Exome sequencing identifies GRIN2A as frequently mutated in melanoma. Nat Genet黑色
5、素瘤发生率一直在上升，此研究对黑色素瘤细胞进行外显子组捕获测序，发现了和其相关的高频突变基因。（某种类型疾病与暴露因素相关性研究）,基因组DNA打断,外显子捕获富集,文库建立,测序,原始数据下机,数据过滤质控,Shooting Gun,参考序列,无,有,Indel, SNP 统计氨基酸突变研究GO功能分析KEGG通路分析,测序深度评估测序覆盖度评估测序随机性评估,分析内容,测序评估,七个新发现的非同义高频突变位点,单个基因中突变位点分析,基因GRIN2A模式图，箭头表示突变位点,What can/would we do?,基于全外显子测序的家族遗传性肿瘤疾病易感性研究（以下以胃癌为例）,胃癌（
6、Gastric Cancer）全球：第四大常见癌症；第二大癌症死亡率 平均5年存活率22%，晚期5年存活率低于5%，男女发病率2:1中国：恶性肿瘤中居首位，西北与东南沿海地区发病率更高风险：家族遗传、HP、饮食结构、癌前胃部疾病、吸烟等家族遗传因素：胃癌病人亲属的胃癌发病率较普通人高4倍以上 10%胃癌在家族中遗传 1%-3%为CDH1基因突变带来的家族弥漫性胃癌，其他 原因目前未知,罕见类型或特殊病理类型！,家族性胃癌是指：高发病率区(如中国)一级和(或)二级亲属中3例患病其中1例是另2例的一级亲属连续两代发病至少有1例发病年龄50岁。,突破点在于：1、发现罕见疾病家系2、收集完整家族血液样
7、本3、剔除抑制突变、SNP及同义突变4、发现新的突变SNPcopy number,肥胖与HP（+）胃癌的关系研究,胃癌（Gastric Cancer）全球：第四大常见癌症；第二大癌症死亡率 平均5年存活率22%，晚期5年存活率低于5%，男女发病率2:1中国：恶性肿瘤中居首位，西北与东南沿海地区发病率更高风险：家族遗传、HP、饮食结构、癌前胃部疾病、吸烟等家族遗传因素：肥胖和肿瘤是全球两大重要的公共卫生问题。 肥胖可以增加胃癌罹患率,并且治疗效果差、 肿瘤病死率高,但具体机制尚不清楚。 肥胖与胃癌均存在一定家族遗传性,全外显子捕获测序获得初筛数据,Step 2,Step 3,先证者,母亲,父亲,
8、DNA/RNA Extraction,Next-generation Sequencing,数据库比对,SNV、indel analysis、mutant genes,RT-PCR、IHC of target genes in tissues of proband,功能研究,Blood Samples,In vitro/ vivo study,5 Trios with HP（+）,Tissues,TRIO家庭三口之家,肥胖的定义,1.BMI: 30kg/ obesity,2.WHR or WHtR（waist-to-hip ratio or waist-to height ratio Male
9、： 0.95 obesity Female：0.8 obesity,三人同时满足！,HP（+）的定义,胃镜取活检标本检查，分离培养+直接涂片检查+病理切片未经任何治疗,胃癌的定义,胃镜取活检标本检查，病理检测未经任何治疗腺癌(包括乳头状腺癌、管状腺癌、粘液腺癌、印戒细胞癌),先证者一人满足！,C14呼气试验能否确诊HP（+）？,实验组,对照组,3-5 TRIOs,肥胖家庭,非肥胖家庭,HP（+）,外显子测序,普通测序验证,De Novo 突变,体外及动物实验,3-5 TRIOs,HP（+）,外显子测序,普通测序验证,De Novo 突变,体外及动物实验,其他标准：性别比 TNM 分期 先证者年
10、龄,质控,标本采集：TRIO全血采集（与测序公司讨论所需血样体积），采用抗凝管DNA提取（QIAmp DNA Blood Mini kit）及保存 （1）样品纯度：OD 260/280值应在1.82.0 之 间；RNA free。 （2）样品浓度：最低浓度不低于50ng/l。 （3）样品总量：每个样品总量不少于15g。 （4）样品溶剂：溶解在H20或TE （pH 8.0）中。 （5）保存：DNA低温运输（-20，干冰）,临床应用,基于测序的肿瘤个人疾病ID建立与个体化治疗方案,癌症突变用药数据库,其他优势,数万份案例临床实验数据库NCCN及FDA数据库结合人群用药情况（中国）专人监测，实时更新,血液样本监测遗传信息监测二/三期临床药物推荐,私人订制！,石蜡包埋组织切片或组织块新鲜冰冻组织血液和骨髓其他,检测流程,CDK,VEGF,损伤修复基因,MDM2,反馈调节,切断肿瘤血供,GD-AIF,BAI-1,TSP,血管生成因子,抗血管生成因子,p53,Ku70,DNA-PK,ATM,逆转放疗抗性,MDR,逆转化疗抗性,细胞周期阻滞,MMP,抑制肿瘤浸润转移,NK,旁杀伤效应,a(II)PH,细胞凋亡,促进作用抑制作用,肿瘤患者ID,
