1、.霉菌试验培训教程空军装备环境与可靠性试验中心霉菌试验培训教程 空军装备环境与可靠性试验中心1实验部分实验一 霉菌试验室常用的器皿微生物学实验室所用的玻璃皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。一般，玻璃器皿的质量要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂烧灼而不破损；器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤方法不恰当也会影响实验结果。一、器皿的种类、要求和应用1.试管微生物学实验所用的玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这样在塞棉花塞时，管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口，不然，
2、微生物容易从棉花与管口进入试管而造成污染。棉塞可用棉花塞、试管帽，橡胶塞等。试管的大小常选用中试管(约 1315100150mm)。2.玻璃吸管(又称移液管)霉菌试验室一般要准备 1、5、10ml 的刻度玻璃吸管，与化学实验室所用的不同，其刻度指示的容量往往包括管尖的液体体积，亦即使用时要注意将所吸液体吹尽，故有时称为“吹出”吸管。3.培养皿常用的培养皿，皿底直径 90mm，高 15mm。培养皿一般为玻璃皿盖。在培养皿内倒入适量培养基制成平板，用于分离、纯化、鉴定菌种以及微生物计数等。4.三角烧瓶与烧杯三角烧瓶有 100、250、500、1000ml 等不同的大小，常用来盛无菌水、培养基和摇瓶
3、发酵等。常的烧杯有 50、100、250、500、1000ml 等，用来配制培养基和药品。5.载玻片与盖玻片普通载玻片大小为 7525mm，用于微生物涂片、染色，作形态观察等。盖玻片为1818mm。6.双层瓶由内外两个玻璃瓶组成，内层小锥形瓶盛放香柏油，供油镜头观察微生物时使用，外层瓶盛放二甲苯，用以擦净油镜头。7.滴瓶用来装各种染料、生理盐水等。霉菌试验培训教程 空军装备环境与可靠性试验中心28.接种工具接种工具有接种环、接种针、接种钩、接种铲、玻璃涂布器等。接种环、针、钩、铲的金属可用铂或镍，原则是软硬适度，能经受火焰反复烧灼，又易冷却。9.容量瓶常见的容量瓶有 100、250、500、1
4、000ml 等不同的大小，常用来定容溶液体积。二、玻璃器皿的清洗方法清洁的玻璃器皿是实验室得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同。1.新玻璃器皿的洗涤方法新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般用 2%的盐酸或洗涤液。浸泡后用自来水冲洗干净。2.使用过的玻璃器皿的洗涤方法(1)试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。玻璃器皿经洗涤后， 内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全冼净，
5、若挂有水珠，则还需要洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。长有霉菌的培养物先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。(2)玻璃吸管 吸过菌体或孢子悬浮液的玻璃吸管使用后应立即投入盛有 2%煤酚皂溶液或0.25%新洁尔灭消毒液或巴斯消毒液的量筒或标本瓶内，24 小时方可取出冲洗。吸取其它溶液的吸管应立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内，以免干燥后难以洗净。吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。(3)载玻片与盖玻片 用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸
6、510 分钟，用软布或脱脂棉花擦轼，立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡 0.52 小时，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于 95%酒精中保存备用。使用时在火焰上烧去酒精。用此法洗涤和保存的载玻片和盖玻片清洁透亮，没有水珠。检查过活菌的载玻片和盖玻片应先用 2%煤酚皂溶液或 0.25%新洁尔灭消毒液浸泡 24 小时，然后按上述方法洗涤与保存。3.洗涤液的配制与使用（1）洗涤液的配制洗涤液分浓溶液与稀溶液两种，配方如下：浓溶液：重铬酸钠或重铬酸钾(工业用) 50g自来水 150ml浓硫酸(工业用) 800ml稀溶液：重铬酸钠或重铬酸钾(工业用) 50g霉菌试验培训教程 空军装备
7、环境与可靠性试验中心3自来水 850ml浓硫酸(工业用) 100ml配法都是将重铬酸钠或重铬酸钾先溶解于自来水中，可慢慢加温，使溶解，冷却后徐徐加入浓硫酸，边加边搅动。配好后洗涤液呈棕红色或桔红色，长期使用后变成墨绿色即为失效。贮存于有盖容器内。使用时注意安全。三、玻璃器皿的包装略。实验二 消毒与灭菌灭菌与消毒是有区别的。灭菌是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体。灭菌与消毒的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。在霉菌试验过程中有许多步骤是要求无菌操作的，因此灭菌是整个试验中的重要环节。灭菌的彻底与否将直接影响试验结果的准确程度
8、，能否确切地反映霉菌试验的真实情况，也是关系到试验结果的可靠性。常用灭菌方法有加热法灭菌、紫外线灭菌、化学药品灭菌。一、加热灭菌1.干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。通常说的干热灭菌是在电烘箱内灭菌，此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌，在热空气 160170下保温 2 小时进行灭菌。2.高压蒸气灭菌高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能
9、溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于 100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。高压湿热蒸汽灭菌有较大的渗透力，容易使蛋白质凝固和变性，是一种可靠的灭菌方法。它能杀死一切微生物。其特点是杀菌可靠、经济、快速、无臭、无味和无毒性，能达到安全有效。灭菌时，先取出灭菌桶，再向外层锅内加入适量的清水（水没过电阻丝） ，放回灭菌桶，并将待灭菌的器皿以及被霉菌污染的物品用纸（牛皮纸、旧报纸）包装好装入高压灭菌锅内，注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。加盖，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使
10、螺栓松紧一致，勿使漏气。打开电源加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷气完全排尽(蒸汽霉菌试验培训教程 空军装备环境与可靠性试验中心4从气门有力的冲击)关闭排气阀，随后压力上升,直到指针到 0.105Mpa，锅内温度为 121.3为止，控制电源电压，维持压力并保持 2030min。灭菌时间即将结束时，停止加热，让灭菌锅自行降压，等压力锅指针回到接近零时即可开启放气阀，使锅内蒸汽排空，然后揭开盖至 1/3 左右，利用余热烘干试管塞，再取出已灭菌的物品，如果压力未降到会位，切勿打开盖子，以免压力容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。将取出的灭
11、菌培养基放入 291恒温培养箱内培养 24 小时，经检查无杂菌生长，即可待用。蒸汽压力与蒸汽温度换算的关系如表 1 所示。表 1 蒸汽压力与蒸汽温度换算的关系压 力 表 读 数 蒸汽温度蒸汽压力大气压 千克/厘米 2 (Kg/cm2) 磅/英寸2（1b/in2）1.00 0.00 0.00 100.01.25 0.25 3.75 107.01.50 0.50 7.50 112.01.75 0.75 11.25 115.02.00 1.00 15.00 121.02.50 1.50 22.50 128.03.00 2.00 30.00 134.5二、紫外线灭菌紫外线灭菌是利用紫外线灯照射进行的，
12、波长为 200300nm 的紫外线都有杀菌能力，其中以 260nm 的杀菌力最强。紫外线灯距照射物以不超过 1.2 米为宜，为了加强灭菌效果，在开紫外线灯之前，可先在无菌室内喷洒 2%5%的来苏儿溶液，照射时间应在 0.5 小时2 小时。紫外线对人体有害，不能直视开着紫外线灯。三、化学药品灭菌化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。即利用化学药剂进行灭菌。试验室桌面、用具以及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒灭菌。常用的 2%来苏尔、0.25% 新洁尔灭、1%升汞、35%的甲醛溶液、75%酒精溶液等。常用化学杀菌剂的浓度及应用范围见表 2：表 2 常用化学杀菌剂的浓度
13、及应用范围类 别 杀菌剂名称 常用浓度 应用范围醇 类 乙醇 50-70% 皮肤及器械消毒乳酸 0.33-1mol/L 空气消毒（喷雾或熏蒸）酸 类 食醋 35ml/m 3 熏蒸消毒空气，可预防流感病毒霉菌试验培训教程 空军装备环境与可靠性试验中心5碱 类 石灰水 1-3% 地面消毒石炭酸 5% 空气消毒（喷雾）酚 类来苏尔 2-5% 空气消毒、皮肤消毒醛 类 福尔马林 40%溶液 2-6ml/m3 接种室、接种箱或接种房熏蒸消毒升汞 0.1% 植物组织（如根瘤）表面消毒重金属离子硝酸银 0.1-1% 皮肤消毒高锰酸钾 0.1-3% 皮肤、水果、茶杯消毒过氧化氢 3% 清洗伤口氯气 0.2-1
14、ppm 饮用水清洁消毒氧化剂漂白粉 1-5% 洗刷培养基、饮用及粪便消毒去污剂 新洁尔灭 水稀释 20 倍 皮肤、不能遇热的器皿消毒染 料 结晶紫 2-4% 外用紫药水，浅创伤口消毒金属螯合剂 8-羟基奎啉硫酸盐 0.1-0.2% 外用、清洗消毒甲醛熏蒸：福尔马林（40%甲醛）10ml 加高锰酸钾 5g/m3 密封熏蒸 6h 以上，福尔马林12.5ml/m3 加入等量的水加热蒸发，熏蒸 6h 以上。实验三 培养基的制备和灭菌培养基是一种人工配制的、适合微生物生长繁殖，并累积新陈代谢产物的混合养料。它通常含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六大类成分。根据微生物种类和试验目的不同，培养基的
15、种类和配制方法也不一样。 （如按营养成分分：天然培养基（PDA）和合成培养基（Czapek） ；按物理状态分：固体培养基、半固体培养基、液体培养基；等等。 ） 。霉菌试验常用的培养基有：查氏培养基（Czapek） 、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA） 、滤纸培养基、真菌培养基等。1培养基成分的配比（1）查氏（Czapek）培养基配制：NaNO3 3.0g K2HPO4 1.0gKCl 0.5g MgSO4 0.5gFeSO4 0.01g 蔗糖 30.0 g琼脂 1520 g 水 1000mlpH 自然1.05 kg/cm2（15 磅/英寸） ，121.3灭菌 20 分钟。（2）马铃薯培养基配制：
16、马铃薯 200.0 g 蔗糖(或葡萄糖) 20.0 g琼脂 15.020.0 g 水 1000mlpH 7.2马铃薯去皮，切成 1cm3 的小块，煮沸半小时后，用 4 层纱布过滤，再加糖及琼脂，加热溶化后补足水分至 1000ml。1.05 kg/cm 2（15 磅/英寸） ，121.3灭菌 20 分钟。霉菌试验培训教程 空军装备环境与可靠性试验中心6（3）滤纸培养基(NH4)2SO4 1.0g K2HPO4 1.0gNaCl 0.5g MgSO47H2O 0.7g琼脂 1520 g 水 1000mlpH 自然 滤纸条(摆斜面时加入) 6cm1cm将培养基与滤纸条在 1.05 kg/cm2（15
17、 磅/英寸） ，121.3条件下分别灭菌 20 分钟。（4）无机盐培养基(NH4)2NO3 1.5g K2HPO4 1.0gKCl 0.25g MgSO47H2O 0.5gFeSO4 0.002 琼脂 1520g水 1000ml pH 自然将培养基在 1.05 kg/cm2（15 磅/英寸） ，121.3条件下灭菌 20 分钟。若培养球毛壳霉则在斜面上加滤纸条(6cm1cm)，将培养基与滤纸条在 1.05 kg/cm2（15 磅/英寸） ，121.3条件下分别灭菌 20 分钟，在摆斜面前加入到试管斜面上。2器皿天平（精确度为 0.001g） ，2000ml 搪瓷锅，电炉或电磁炉，石棉网，500
18、ml 烧杯，300ml 锥形瓶，1000ml 量筒，漏斗，15150mm 试管，玻璃棒，1ml、10ml 吸管，滴管，pH 试纸，牛角匙，洁净纱布，油皮纸，棉花，橡皮筋等。3制备方法按不同培养基成分配比称量各种药品，用量筒量取 700ml 蒸馏水于搪瓷锅中，加热至沸腾后加入琼脂使其溶解，再依次加入其它各成分，用玻璃棒搅拌溶解后，用 1mol/L HCL 调节 pH至 7.2。趁热分装在试管内或三角瓶内（分装装置如图 1 所示） ，分装后的容量不超过其容量的1/5，三角瓶不超过其容量的 1/2。塞好棉塞（棉塞的制作方法如图 2 所示） ，用防潮纸包好，试管每 7 支一捆。准备灭菌。4灭菌各培养基
19、均可在 1.05 kg/cm2（15 磅/英寸 2） ，121.3条件下分别灭菌 20 分钟。图 1 三类不同的分装装置霉菌试验培训教程 空军装备环境与可靠性试验中心75.摆斜面灭菌后待培养基冷却至 5060时，将试管口一端搁在高度适中的木棍上，调整搁置的斜度，使斜面长度不超过试管总长度的 1/2。如图 3 所示。对于滤纸培养基的灭菌，培养基与滤纸先分别灭菌，之后再在超净工作台内酒精灯火焰旁边分别用无菌镊子将无菌滤纸夹入到试验斜面上，再摆斜面。培养基凝固后放置在低温冰箱内保存待用。图 2 棉塞的制作方法 图 3 摆斜面6.倒平板灭菌的培养基溶化后，待冷却至 5560时，便可将培养基倒入已灭菌的
20、平皿内。方法是右手持盛培养基的三角瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果三角瓶内的培养基一次可用完，则三角瓶塞不必夹在手指中。三角瓶在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约 15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住瓶塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板。将平板放在室温2-3 天，或 37培养 24 小时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。目前已配方好的各种培养基在许多生物化学试剂公司均能购买到，按使用说明按比例进行配比即可，方便
21、快捷。实验四 接种与培养1斜面接种(1)用记号笔或标签将接种的菌名、接种日期和接种者写在试管壁上或写在标签上贴于离试管口约 3cm 处的培养基斜面的正上方。(2)点燃酒精灯，并将火焰调至适中.(3)将菌种试管及待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指和无名指握在左手中，并将中指夹在两试管之间，使斜面向上，成水平位置，在火焰边用右手松动试管塞，以利于接种时拔出。(4)右手握在接种针（环）的胶木柄上，将接种针（环）通过火焰的外焰进行灼烧进行灭菌，霉菌试验培训教程 空军装备环境与可靠性试验中心8在火焰边用右手的手掌边缘和小指，小指和无名指分别夹持棉塞，将其拔出，并迅速烧灼管口。(5)将烧灼的接种针（环
22、）伸入菌种试管内，先使接种针（环）轻触试验管内壁或未生长菌的培养基，达到冷却的目的，然后挑取少许菌苔。将接种针（环）退出菌种试管，迅速伸入接种斜面试管，若用接种环则在斜面上自试验管底部向上端轻轻地划直线，勿将培养基划破，也不要使接种环接触管壁或管口，若用接种针则将菌苔轻轻点击在培养基内。（6）接种环退出斜面试管，再用火焰烧管口，并在火焰边将试管塞塞上。将接种针（环）逐渐接近火焰，再烧灼。如果接种针（环）上沾的菌体较多时接种针（环）在火焰边烤干，然后烧灼，以免未烧死的菌种飞溅污染环境。2平板接种(1)用记号笔或标签将接种的菌名、接种日期和接种者写在培养皿底部上或写在标签上贴于培养皿底部。(2)点
23、燃酒精灯，并将火焰调至适中。(3)将菌种试管及待接种的平板有序放置在无菌操作台内，用大拇指和食指、中指和无名指握在左手中，斜面向上，成水平位置，在火焰边用右手松动试管塞，以利于接种时拔出。(4)右手握在接种针（环）的胶木柄上，将接种针（环）通过火焰的外焰进行灼烧灭菌，在火焰边用右手的手掌边缘和小指夹持棉塞，将其拔出，并迅速烧灼管口。(5)将烧灼的接种针（环）伸入菌种试管内，先使接种针（环）轻触试验管内壁或未生长菌的培养基，达到冷却的目的，然后挑取少许菌苔。将接种针（环）退出菌种试管，用火焰烧管口后在火焰边将试管塞塞上，放回原位。右手握住接种针（环）放在火焰附近，切勿接近火焰或靠得太近。（6）左
24、手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，将接种针（环）迅速伸入接种平板，若用接种环则在平板上由内向外轻轻地划之字形线，勿将培养基划破，也不要使接种环接触平皿上盖或平皿壁，若用接种针则将菌苔轻轻点击在平板中间位置，合上皿盖，将平板放置在桌面上。（7）将接种针（环）逐渐接近火焰，再烧灼。如果接种针（环）上沾的菌体较多时接种针（环）在火焰边烤干，然后烧灼，以免未烧死的菌种飞溅污染环境。以上两种接种方法均为无菌操作。将已接种的斜面或平板培养基放置在 2830培养箱内培养。实验五 显微镜的使用一.显微镜的基本构造显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成。1.机械装置镜座、镜筒、转换器、载物台、调焦装置等组成。2.
25、光学系统霉菌试验培训教程 空军装备环境与可靠性试验中心9物镜 物镜安装在镜筒下端的转换器上。其作用是将物体作第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如NA 0.30；10；160/0.17；16mm。其中“NA 0.30 ”表示数值孔径， “10”表示放大倍数，“160/0.17”分别表示镜筒长度和所需的盖玻片厚度 (mm)，16mm 表示焦距。目镜 装于镜筒上端，由两块透镜组成。目镜上一般标有10、15等放大倍数，可根据需要选用。一般可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的 500700 倍，最大也不能超过 1000倍。光源
26、 显微镜的光源通常安装在显微镜底座内，通过按钮开关来控制。3.油镜油镜（1.8mm,95100）通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI（oil immersion） ”字样表示。使用油镜时镜头离标本十分近，需要特别小心。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率 n=1.52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径。因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度的半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射
27、率所得的乘，可用下列公式表示：NA=nsin式中 NA=数值孔径n=介质折射率=最大入射角的半数，即镜口角的半数。二.显微镜的操作：1.观察前的准备显微镜应放大一个相对固定的位置镜座距实验台边沿约 34cm。镜检者姿势端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳。打开电源开关，调节好亮度。2.低倍镜观察检查的标本需先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。将制好的标本放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使观察对象处在物镜正下方，转动粗调节器，使物镜降至距标本约 0.5cm 处，由目镜观察。用粗调节器慢慢升起镜筒，直至物像出现后再用细调节器调节到物像清楚时为止，然后移动标本，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，并将其移至视野中心，准备用高倍镜观察。3.高倍镜观察将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后由目镜观察，并仔细调节光线，使光线的明亮度适宜，同时用粗调节器慢慢升起镜筒至物像出现后，再用细调节器调节至物像清晰为止，找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。
