1、用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸,姓名：张秀婷班级：生物制药1211,一、基础知识,弗氏柠檬酸菌 柠檬酸菌属直杆菌、直径约1.0，长2.06.0m，单个和成对。 柠檬酸杆菌属是肠道菌中常见的非致病菌，由于该菌与肠道中的致病菌沙门氏菌十分相似，故在肠道细菌的分类鉴定中非常重要。,L-丝氨酸的基础知识,英文名：L-Tyrosine 学名：2-氨基-3-对羟苯基丙酸。一种含有酚羟基的芳香族极性氨基酸。是组成蛋白质的20种氨基酸中的一种，是哺乳动物的必需氨基酸，又是生酮和生糖氨基酸。符号：YCASNo.：60-18-4产品描述：白色结晶体或结晶粉末，无味，易溶于甲酸，难溶于水，不溶于乙醇和乙醚。在稀盐
2、酸或稀硝酸中溶解。 生产标准：AJI92，USP26，EP4 分子式：C9H11NO3 相对分子量或原子量：181.20 密度：1.456 比旋度：-11.3至-12.1,【性状】 l-体从水中结晶出来者，无色至白色丝光针状结晶或结晶性粉末；d-体从水中结晶者为无色晶体；dl-体从水中结晶者为有光泽的针状晶体。为动物体内非必需氨基酸！【制备或来源】 由含蛋白质的物质（废丝、酪蛋白和玉米等）水解液中提取； 以葡萄糖为原料，经短杆菌出发诱导的l-酪氨酸生产菌发酵而得； 以苯酚、丙酮酸、氨为原料，利用-酪氨酸酶催化制取,L-丝氨酸的结构式,【用途】与糖类共热可产生氨基羰基间的反应，而产生一种特殊的香
3、料。必需氨基酸。酪氨酸是酪氨酸酶单酚酶功能的催化底物，是最终形成优黑素和褐黑素的主要原料。在美白化妆品研发中，可以通过研究合成与酪氨酸竞争的酪氨酸酶结构类似物也可有效地抑制黑素的生成。,二、L-酪氨酸的酶法合成,L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，应用酶法取代水解法生产L-酪氨酸是近年来氨基酸工业的研究热点之一。酪氨酸酚裂解酶( tyrosine phenol-lyase，TPL，EC4) ，也称 -酪氨酸酶，在生物体内催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为L-酪氨酸而L-酪氨酸常作为营养增补剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸，以及L-多巴、
4、黑色素、对羟基肉桂酸、对羟基苯乙烯等医药化工产品的制备原料。,TPL催化L-酪氨酸裂解的最适pH为8.2，pH6.0时该酶基本没有活性。一般认为这种高、低pH情况下的酶活差异是由于pKa约为7.8的二种催化碱的质子化引起的。,工艺路线,1、丙酮酸路线L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，收率低，环境污染严重，应用酶法取代水解法生产L-酪氨酸具有重要的应用价值。用TPL合成L-酪氨酸，首先开展的工艺是丙酮酸路线。Para等将包埋于聚丙烯酰胺凝胶中的C.intermiedius固定化细胞作为催化剂，分批添加底物，建立75mmol/L丙酮酸钠、45mmol/L硫酸铵、45mmol/L氯
5、化铵和55mmol/L苯酚的转化体系，反应5h后可积累L-酪氨酸10g/L。若将反应体系置于连续的柱反应器内，苯酚对L-酪氨酸的转化率达90%，且稳定性可维持5d。,2、L-丝氨酸路线由于L-丝氨酸可通过丝氨酸羟甲基转移酶(EC2121)催化甘氨酸和甲醛廉价制备，Lee等用产气克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)和EHerbicola ATCC 21434分别作为丝氨酸羟甲基转移酶和TPL的酶源，将以甘氨酸为底物合成L-丝氨酸的反应和以L-丝氨酸为底物合成L-酪氨酸的反应相偶联，反应体系含甘氨酸025mol/L、PLP05mmol/L、四氢叶酸07mmol/L、初始苯酚浓度03
6、2%，以37%甲醛启动反应16h后，可产生L-酪氨酸263g/L，甘氨酸转化率为614%，但该工艺存在甘氨酸对TPL抑制较强和操作复杂的明显不足。,3、S-邻硝基苯-L-半胱氨酸(SOPC)是TPL适宜的人工底物，其Vmax比生理底物L-酪氨酸高三倍，而Km仅为L-酪氨酸的50%。Phillips等以CFreundii ATCC 29063细胞悬液作为酶源，4mmol/LSOPC和4mmol/L苯酚反应2h，苯酚的转化率就达到70%，而且这一反应的最适pH较为宽泛(6890)。不过，SOPC价格较高，从而限制了该工艺的工业化应用。,酶法合成产物L-酪氨酸的分析鉴定,酪氨酸酪氨酸的测定电位滴定法
7、本方法适用于酪氨酸的含量测定。 方法原理：供试品加无水甲酸溶解后，再加冰醋酸适量，照电位滴定法（附录 A），用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于18.12mg的C9H11NO3。,电位滴定法是在滴定过程中通过测量电位变化以确定滴定终点的方法，和直接电位法相比，电位滴定法不需要准确的测量电极电位值，因此，温度、液体接界电位的影响并不重要，其准确度优于直接电位法普通滴定法是依靠指示剂颜色变化来指示滴定终点，如果待测溶液有颜色或浑浊时，终点的指示就比较困难，或者根本找不到合适的指示剂。电位滴定法是靠电极电位的突跃来指示滴
8、定终点。在滴定到达终点前后，滴液中的待测离子浓度往往连续变化n个数量级，引起电位的突跃，被测成分的含量仍然通过消耗滴定剂的量来计算。,使用不同的指示电极，电位滴定法可以进行酸碱滴定，氧化还原滴定，配合滴定和沉淀滴定。酸碱滴定时使用PH玻璃电极为指示电极，在氧化还原滴定中，可以从铂电极作指示电极。在配合滴定中，若用EDTA作滴定剂，可以用汞电极作指示电极，在沉淀滴定中，若用硝酸银滴定卤素离子，可以用银电极作指示电极。在滴定过程中，随着滴定剂的不断加入，电极电位E不断发生变化，电极电位发生突跃时，说明滴定到达终点。用微分曲线比普通滴定曲线更容易确定滴定终点。 如果使用自动电位滴定仪，在滴定过程中可
9、以自动绘出滴定曲线，自动找出滴定终点，自动给出体积，滴定快捷方便。,试样制备： 1. 高氯酸滴定液（0.1mol/L）配制：取无水冰醋酸（按含水量计算，每1g水加醋酐5.22mL）750mL，加入高氯酸（7072%）8.5mL，摇匀，放冷，加无水冰醋酸适量使成1000mL，摇匀，放置24小时。若所测供试品易乙酰化，则须用水分测定法测定本液的含水量，再用水和醋酐调节至本液的含水量为0.01%0.2%。 标定：取在105干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.16g，精密称定，加无水冰醋酸20mL使溶解，加结晶紫指示液1滴，用本液缓缓滴定至蓝色，并将滴定结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液（0.1
10、mol/L）相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。, 结晶紫指示液取结晶紫0.5g，加冰醋酸100mL使溶解。贮藏：置棕色玻璃瓶中，密闭保存。操作步骤：取该品约0.15g，精密称定，加无水甲酸6mL溶解后，加冰醋酸50mL，照电位滴定法（附录 A），用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于18.12mg的C9H11NO3。注1：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一,“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。注2：“
11、水分测定”用烘干法，取供试品25g，平铺于干燥至恒重的扁形称瓶中，厚度不超过5mm，疏松供试品不超过10mm，精密称取，打开瓶盖在100105干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30分钟，精密称定重量，再在上述温度干燥1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量（%）。,纸层析 分析鉴定酶法合成的酪氨酸,纸层析法是利用各物质不同的分配系数，使混合物随流动相时而得到分离的方法。纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的。滤纸纤维与水亲和力较强，而与有机溶剂亲和力弱，所以纸层析以滤纸纤维和结合水为固定相，以有机溶剂为流动相。当有机相沿滤纸流动经过样品点时
12、，样品点上的溶液在水相和有机相之间进行分配，样品移动速率与样品的极性及水亲和力有关，因此，极性氨基酸移动较慢，而非极性氨基酸移动较快。,溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示： Rf =原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离= X/Y在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。 Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。,实验试剂,1. 展层剂和平衡液 正丁醇:冰醋酸:水=4:1:5，充分摇匀，用分液漏斗取上层液作展层剂；下层液作平衡液(弃去)。2. 样品液 用水配成每ml含有丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸各4mg/ml的氨基酸溶液，以及
13、上述四种氨基酸的混合液(各4mg/ml)。3. 茚三酮 按展层剂0.25%的比例将茚三酮加入展层剂中，使其溶解。,（1）检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120烘干。（2）规划：取宽约16cm、高约16cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度,（3）点样：在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号(混合样可写M)，然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点第二次。前三种氨基酸各点3次，混合液点6次。将点过样的滤纸用针线卷成筒状（点样面向内），注意纸的两边不能接触，留一定缝隙。 注意： 点样用的毛细管和试剂瓶上的氨基酸是一一对应的，千万不能混淆，以免污染,（4）层析：将培养皿中放入2/3量的展层剂，迅速放置于层析缸中。把滤纸筒转移到此培养皿内，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点。当溶剂前沿到达滤纸2/3处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿。注意：点样端朝下，点样处不能没 入层析液中，滤纸不能贴壁（5）显色：热风吹干滤纸至显出氨基酸斑点，用铅笔描出轮廓。,
