1、VEGF生物学基础与朗沐药学基础知识,陶杉杉,目录,VEGF的定义,VEGF:Vascular Endothelial Growth Factor,血管内皮生长因子,是一类多功能的细胞因子,在血管生成和淋巴管生成中具有直接和间接的调控作用。VEGF主要有7种亚型:VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E,VEGF-F和PlGF(Placenta Growth Factor)。其中只有VEGF-A,VEGF-B和PlGF与血管新生相关。,VEGF的分子结构,VEGF-A的基因经过剪切拼接后可形成不同单体,如121, 165,183等。数字代表相应的氨基酸残基数量。其中
2、VEGF165是眼部新生血管的主要诱因。VEGF通常以同源二聚体的形式存在,2个亚基的分子质量(MW)为1723 kDa,通过两对二硫键共价连接。kDa: kiloDalton,千道尔顿,也写作kD。,VEGF的合成和靶细胞,所有眼部分布血管的组织都可合成表达VEGF,相关细胞包括:视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE),周皮细胞(也称周细胞),内皮细胞,穆勒细胞和基质细胞等。VEGF的主要靶向细胞为血管内皮细胞,RPE,视网膜外层,穆勒细胞,视网膜中层,视网膜内层,视网膜感觉神经细胞,VEGF的作用,1. VEGF可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移和
3、存活;2. VEGF可以增加血管通透性,扩张血管;3. VEGF可以聚集血管前体细胞和单核细胞。,VEGFR的定义,VEGFR:Vascular Endothelial Growth Factor Rceptor,血管内皮生长因子受体,是一类受体酪氨酸激酶跨膜糖蛋白,与VEGF结合后通过构象变化和磷酸化传递相应信号。VEGFR主要有3种亚型:VEGFR-1,VEGFR-2和VEGFR-3。VEGF刺激内皮细胞的增殖、增加血管的通透性和新血管的生成作用主要是通过结合和激活VEGFR-2来实现的。VEGFR-3不参与血管新生信号通路中。,VEGF受体的分子结构,VEGFR平时以单体形式存在。分为胞
4、外区、跨膜区和胞内区三大部分。胞外区部分由7个与免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)结构相似的结构域组成。胞内区部分属于酪氨酸激酶区,可以发生自磷酸化来向下游传递信号。,VEGF受体的分子结构,VEGFR的胞外区的7个免疫球蛋白样结构从N端开始依次命名为D1-D7。VEGFR-1(Flt-1)可以结合VEGF-A、VEGF-B和PlGF,其D2区就是与配体结合的位点。VEGFR-2(KDR,Flk-1)只能结合VEGF-A,其D2和D3区是配体结合位点,D3区对于配体结合的专一性起作用。D4区对受体的二聚体化很关键,并可增强VEGF与VEGFR的结合速率。,D1,D7,VEGF与眼
5、部新生血管疾病有关,证据:脉络膜新生血管膜中检测到VEGF165 ,VEGF-B和PlGF;PDR(增殖性糖尿病视网膜病变)患者的玻璃体腔中PlGF的浓度明显升高;眼内注射VEGF会引起和DR相同的表现,如微动脉瘤、出血、视网膜和虹膜新生血管。以上说明,VEGF与眼部新生血管疾病有关:1. 从通透性到新生血管构建,视网膜脉管系统的病态改变都与VEGF表达量增加有关。2. 仅需VEGF就可触发眼内新生血管形成。3. 抑制VEGF可改善眼部功能和结构。,VEGF表达增加的诱因,缺氧、炎症和机械力会上调细胞合成VEGF。,VEGF的作用机制,VEGF结合到VEGFR,通过D4区使其发生二聚体化现象,
6、VEGF则桥接在受体的D2区或者D2和D3区之间。,VEGF的作用机制,VEGF与VEGFR的结合会引发受体构象变化和自磷酸化,并使下游蛋白发生磷酸化,传递血管新生和血管渗漏的信号。,P,P,眼部新生血管类疾病种类,VEGF诱发的病态性血管新生疾病主要分为两种:肿瘤和眼部新生血管失调。眼部新生血管疾病根据临床表现又可分为三种:增殖型(Proliferation),渗漏型(leakage)和增殖渗漏型(Proliferation and leakage)。增殖型眼病:增殖型糖尿病视网膜病变(PDR),早产儿视网膜病变(ROP),新生血管性青光眼(NVG)渗漏型眼病:视网膜静脉阻塞(RVO),糖尿
7、病黄斑水肿(DME),中心性浆液性脉络膜视网膜病变(CSC)增殖渗漏型眼病:湿性年龄相关性黄斑变性(wAMD),视网膜血管瘤增殖(RAP),病理性近视CNV(pmCNV),眼部新生血管类疾病的拮抗途径,1.移除诱导VEGF表达量增加的条件:全视网膜激光光凝术,玻璃体切割术改善视网膜内氧环境,降低低氧诱导的VEGF表达;2.下调VEGF和VEGFR的表达:眼内注射曲安奈德,地塞米松3.阻断VEGF与VEGFR的结合:哌加他尼钠特异性结合VEGF-A165;贝伐单抗,雷尼单抗结合所有VEGF-A;阿柏西普,康柏西普结合所有VEGF-A、VEGF-B和PlGF。,康柏西普的生物学与药学基础,康柏西普
8、的来历,抗VEGF药物的阻断途径:1. 通过结合VEGF使之不能再与VEGFR结合2. 通过结合VEGFR使VEGF不能再与受体结合单抗类药物均采用了阻断途径1通过杂交瘤细胞技术获得。,VEGF-A,贝伐单抗,Avastin,雷珠单抗,Ranibizumab,雷珠单抗生产工艺,雷珠单抗和贝伐单抗最开始是以单克隆抗体技术制备筛选的。单克隆抗体技术又叫杂交瘤细胞技术,是融合了小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞来生产抗体的技术。因为小鼠脾细胞经过特定抗原(VEGF)刺激后会产生分泌相应抗体(抗VEGF抗体,如贝伐单抗),但是小鼠脾细胞不能繁殖,如果需要较多量的稳定单抗,就要把脾细胞与可以无限繁殖的肿瘤细胞进
9、行融合,这样既可以分泌抗体又能保持细胞永生。由于VEGF刺激的是小鼠脾细胞,因此产生的抗体无可避免都会有鼠源性的氨基酸序列。而且由于抗体的可变性,不同次的刺激可能产生不同的抗体,因此最后是在多种抗体中筛选出贝伐单抗和雷珠单抗的全体。然后对这两个单抗的氨基酸序列(雷珠是Fab片段的序列)进行鉴定后即可根据基因密码子表获得相应的DNA,然后将DNA序列转入大肠杆菌中进行诱导表达,就能大批量培养获得稳定的雷珠单抗了。因为用大肠杆菌表达蛋白一般来说快速方便稳定又便宜。,康柏西普的来历,抗体存在两个问题:1. 抗体的高度特异性使其只能与VEGF的一个亚型VEGF-A结合,而不表现出对VEGF-B和胎盘生
10、长因子(PlGF)的亲和力;2. 杂交瘤细胞技术生产的抗体部分氨基酸组成和序列是鼠源性的,而非全人源化蛋白。,康柏西普的来历,VEGF的各亚型都通过结合VEGFR-1和2来发挥作用。模拟受体与VEGF结合位点的结构,可降低免疫原性,并能与所有VEGF亚型结合。VEGFR-1和2的胞外域是与VEGF上的不同位点结合,因此这种模拟受体需要融合VEGFR-1和2两种蛋白的配体结合位点才能完全抑制VEGF与受体的结合。,康柏西普的来历,FP3表现出最高的VEGF的亲和力,最强的抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的能力。,VEGFR-1 VEGFR-2,康柏西普的分子量约为143kD,其受体样区域是
11、同源二聚体样结构,很好地模拟了VEGFR与VEGF结合的活性形态康柏西普的7个糖基化位点均发生糖基化,使得康柏西普的pI值在5.68-7.47之间,对眼部刺激性小D4区使得二聚体样结构更稳定更方便VEGF的桥接,也具有更快的VEGF结合速度。,康柏西普的结构,康柏西普生产工艺,康柏西普最开始是从人VEGF受体1和受体2的胞外免疫球蛋白样区域分别随机融合并连上人IgG的Fc片段形成的融合蛋白中筛选出来的,这种融合就是将表达这些蛋白区域的DNA序列通过连接酶有序地连接在一起,再转入CHO细胞中进行诱导表达即可获得。由于DNA对应的蛋白均为人源化蛋白,因此康柏西普是100%全人源化的蛋白。之所以选用
12、CHO细胞,一是因为大肠杆菌中没有辅助真核蛋白正确折叠形成活性状态的酶,因此表达出的分子不可溶、无活性,而CHO作为真核细胞,这些酶是有的;二是因为康柏西普蛋白上有多个糖基化位点,而大肠杆菌不能对人源化的糖基化位点进行糖基化,也会影响蛋白的状态和活性;第三是因为CHO细胞表达技术是现在真核表达细胞中相对成熟稳定的技术,已经用于工业生产。,康柏西普的活性研究,康柏西普的体外活性研究康柏西普的体内活性研究,康柏西普的体外活性研究,ELISA检测FP1、FP3和贝伐单抗对VEGF的亲和力,FP1:阿柏西普;FP3:康柏西普,康柏西普显示出更高的VEGF亲和力。贝伐单抗的特异性使其不能与VEGF-B和
13、VEGF-C以及PlGF结合。,康柏西普:EC50=28 pM 雷珠单抗:EC50=50 pMEC50:半数有效浓度,即能引起50%最大效应的药物浓度。EC50值越大,说明药物的作用越低。,康柏西普和雷珠单抗对VEGF诱导的HUVEC增殖活性的影响,康柏西普的体外活性研究,康柏西普对HUVEC迁移的抑制作用呈现剂量依赖性,其IC50为7nM。IC50:半数抑制浓度, 即能引起50%抑制效应的药物浓度。IC50值越大,说明药物的作用越低。,康柏西普对VEGF诱导的HUVEC细胞迁移过程的影响,康柏西普的体外活性研究,康柏西普可显著抑制VEGF诱导的微血管萌芽和毛细血管样网络形成。,康柏西普对VE
14、GF诱导的微血管萌芽和毛细血管样网络形成的影响,康柏西普的体外活性研究,500 ng/mL的康柏西普即可达到最大结合人视网膜内皮细胞(HREC)分泌的VEGF165的作用,也可显著降低游离的PlGF浓度。,康柏西普对高糖诱导的HREC分泌VEGF-165和PlGF的影响,康柏西普的体外活性研究,500 ng/mL的康柏西普可有效抑制高糖诱导的HREC的迁移。,康柏西普对高糖诱导的HREC迁移的影响,康柏西普的体外活性研究,500 ng/mL的康柏西普可有效抑制高糖诱导HREC形成毛细血管样网络。,康柏西普对高糖诱导的HREC成网过程的影响,康柏西普的体外活性研究,康柏西普治疗组的渗漏明显比未治
15、疗组少,说明康柏西普可抑制新生血管生成。,低氧诱导小鼠缺血性视网膜病变抑制实验的眼底造影,康柏西普的体内活性研究,激光后立刻注射康柏西普,之后B组每周注射一次,C组两周注射一次。B组和C组的渗漏明显比未治疗组少,说明康柏西普可预防新生血管生成。,康柏西普预防恒河猴激光灼伤CNV实验的眼底造影,康柏西普的体内活性研究,康柏西普抑制恒河猴激光灼伤CNV实验的OCT结果,激光灼伤恒河猴后20天,治疗组分别注射康柏西普500、300和100 g,并在注射8天后观察。相比对照组,8天后治疗组均未观察到高反射回声区,RPE恢复连续性,黄斑水肿消除,说明康柏西普可有效抑制CNV。,康柏西普的体内活性研究,康
16、柏西普抑制恒河猴激光灼伤CNV实验的FFA结果-500 g组,激光灼伤20天后,注射0天,注射14天后,注射28天后,康柏西普的体内活性研究,Zhang Ming,et al. Ophthalmology. 2011 Apr;118(4):672-8.,康柏西普治疗后42天,患者BCVA平均提高了19.61个字母。中央视网膜厚度平均降低了77.19 m。,康柏西普的体内活性研究,康柏西普3.0mg组的患者基线和治疗42天后OCT与FFA结果,Zhang Ming,et al. Ophthalmology. 2011 Apr;118(4):672-8.,康柏西普的体内活性研究,康柏西普的药物代谢
17、动力学研究,康柏西普的兔眼药代动力学研究康柏西普的恒河猴药代动力学研究,重要药代指标:Cmax:最大药物浓度,给药后体内检测到的最大药物浓度。Tmax:达峰时间,到达Cmax的时间,所需时间越短,说明药物分散越快。t1/2:药物清除半衰期,药物浓度下降一半所需要的时间,值越大说明药物在体内存留时间越长。,药物代谢动力学的指标,康柏西普的兔眼药代动力学研究,玻璃体腔注射0.5mg(A,Group 1)和1.5mg(B,Group 2)康柏西普在玻璃体、房水、脉络膜-PRE、视网膜中的药代参数,康柏西普注射玻璃体腔后6-12h内在各组织中达到最高药浓度,之后以单指数模式下降,说明在浓度梯度推动下会
18、快速分散到玻璃体腔及周围组织。雷珠单抗在玻璃体腔中的Tmax为24h,但Cmax只有162g/mL,t1/2为2.88天。,康柏西普的兔药代动力学研究,康柏西普在血清中的时药浓度,Group 1: 玻璃体腔注射0.5mg; Group 2: 玻璃体腔注射1.5mg; Group 3: 静脉注射3mg玻璃体腔注射后血清中康柏西普的浓度较低,在6-12天后检测不到。静脉注射后康柏西普以双指数模式消除,半衰期短于玻璃体腔注射。,给予健康猴子单次注射康柏西普,并分别在2、7、15天检测眼部组织中的康柏西普浓度。结果发现,在注射后15天依然可以在眼部组织中检测到康柏西普,且玻璃体腔中浓度最高,说明玻璃体
19、腔中的康柏西普可以长期良好地分布到周围组织中,具有较长的眼内停留时间。,康柏西普的恒河猴药代动力学研究,康柏西普玻璃体腔注射后眼部分布,康柏西普的血清药代动力学指数,康柏西普注射后在设置的时间点取血,检测血清中的康柏西普浓度。结果发现大约4小时后能在血清中检测到,平均34小时后达到峰浓度5ng/ml,这比玻璃体内浓度低1000倍;而0.5mg雷珠单抗在血清中6小时达峰浓度150ng/ml;康柏西普的血清半衰期是45天,而雷珠单抗为3.59天。结果表明,玻璃体腔注射后,与雷珠单抗相比,康柏西普具有更长的眼内停留时间,进入血液循环浓度更低;且经玻璃体腔注射后,二者的血清半衰期相似。,康柏西普的恒河猴药代动力学研究,总结,康柏西普是全人源化的融合蛋白,通过结合VEGF阻断其与VEGFR-1和VEGFR-2的结合,从而阻止新生血管信号传递,抑制新生血管的生长。康柏西普具有很强的体内和体外活性,能明显抑制内皮细胞增殖和迁移,并能有效预防CNV的形成。玻璃体腔注射康柏西普可以在较长时间内良好地分布到周围组织中,具有较长的眼内停留时间和较低的血液循环浓度。,谢 谢,