1、免疫组织化学Immunohistochemistry参考教材 免疫组织化学实验技术及应用主编：倪灿荣等,第一章 绪 论,目 录一、定义和意义二、发展简史三、免疫学概念四、基本类型与原理五、种类六、基本过程,一、免疫组织化学的定义及意义 1、定义 免疫组织化学(Immunohistochemistry)，又称免疫细胞化学(Immunocytochemistry)。 已知的标记抗体（或抗原）原位显示细胞或组织内的相应抗原（或抗体）的方法,进行定性、定量、定位检测。原理：抗原、抗体特异性结合,标记化学反应 酶或其他物质标记抗体 抗原-抗体反应 抗原-抗体复合物 呈色化学反应 底物在酶作用下产生有色物
2、质,2、基本理论,3、优点,高特异性高敏感性方法步骤统一形态、机能与代谢相结合,可定性、定位与定量,4、免疫组织化学的意义,（1）肿瘤诊疗 肿瘤组织起源诊断 肿瘤分型诊断 确定肿瘤的良恶性 确定转移性恶性肿瘤的原发部位 指导肿瘤的治疗、判断预后,（2）病原微生物（肿瘤病因）的检查（3）免疫性疾病的诊断（4）科学研究,二、发展简史,1、1941：COON首次用荧光标记抗体检测肺炎双球菌2、1968：中根一穗建立酶标记抗体技术3、1974年代: sternberger建立PAP技术4、1975：KoeHler等发明了单克隆抗体5、1981：许世明建立抗生物素-生物素标记抗体技术（ABC）6、免疫电
3、镜技术、杂交-免疫细胞化学等7、新发展：Envision二步法、90年代建立的葡萄球菌A蛋白标记法（SPA）,三、免疫学概念 （一）抗原: 1、定义：刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞,结合抗体或致敏淋巴细胞的物质。,2、抗原的两种特性： 免疫原性（immunogenicity）： 诱生抗体或致敏淋巴细胞的能力。 反应原性（antigenicity）： 与抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的能力。,3、抗原决定族（抗原表位）： 特殊的化学活性基团区域,（二）抗体:,1、定义 :机体受抗原刺激后，浆细胞产生的，与相应抗原特异性反应的球蛋白（免疫球蛋白：Ig）。,2、基本结构:,一“Y”字型的四肽链 重链(
4、heavy chain, H)：两条、完全相同 轻链(light chain, L)：两条、完全相同 二硫键：连接四肽链。 二端:氨基端（可变区，V区） 羧基端（恒定区，C区）,（1）可变区（ variable region, V ）： Ig分子氨基端，Aa的组成和排列顺序有变异，决定了抗体结合的特异性。,（2）恒定区（constant region, C ）： Ig分子的羧基端，Aa组成和排列在同一动物种属中同类抗体比较恒定。具有免疫原性,四、基本类型与原理（一）直接法（一步法） 原理：,（二）间接法 原理：,（三）非标记抗体酶法,1、酶桥法 ：以第二抗体作桥，任何抗体都未标记,原理：,一抗
5、和三抗来源于同一种属动物的同类抗体,2、PAP法（peroxidase Antiperoxidase,过氧化物酶抗过氧化物酶法）,原理：预先制备PAP复合物,一抗和PAP复合物中的抗体来源于同一种属动物的同类抗体,（四）亲和素-生物素法亲和素-生物素过氧化物酶法（Avidin Biotin Complex： ABC法）原理：预先制备ABC复合物,五、分类:按标记物的不同免疫荧光组织化学免疫酶组织化学亲和免疫组织化学免疫金-银标记技术免疫双重和多重组织化学杂交免疫组织化学,六.基本过程,(1) 抗原的提取和纯化(2)免疫动物或细胞融合(3)抗体提取与效价检测(4)标记抗体(5)细胞与组织切片标本
6、的制备(6)免疫细胞化学反应和细胞化学显色(7)观察和记录结果,第二章 组织学制片技术,一、定义和意义二、方法三、基本程序四、免疫组织化学石蜡切片制作,一、定义和意义,（一）概念 将机体的组织、器官做成能在显微镜下观察的标本的技术,（二）意义,1、是组织学、胚胎学、病理学等生命科学研究组织细胞的正常与病理形态结构的主要方法。,2、是显示组织、细胞中某些化学成分、基因的定位分布和含量变化的不可缺少的手段。,二、制片方法,（一）非切片法： 1、定义：不经切片机切片手续制成标本的方法。,2、类型：整装片（胚胎）：鸡胚铺片（柔软组织）涂片（液体）磨片（骨、牙）印片（淋巴结）,类型：非切片法、切片,2、
7、类型：根据所用支持剂（包埋剂）的不同，分为：,石蜡切片冰冻切片火棉胶切片法,（二）切片法:1、定义：用切片机(microtome) 切成微米厚的薄片，制出标本切片的方法,三、基本程序,切片法,2、冰冻切片,取材 冷冻 切片 染色 封片,（一）取材：从人或动物体内取下所需组织材料的过程,1、材料来源,（1）人体材料：手术、活检、尸检,（2）动物材料,来源广泛大多数动物组织结构与人体相似有的结构比人类更典型,四、免疫组织化学石蜡切片制作,（1）麻醉： 吸入麻醉：将浸有乙醚或氯仿的棉球连同动物一起放入密闭容器内麻醉。 适用对象：小动物 缺点：乙醚麻醉：肺部充血、呼吸道分泌物增多 注射麻醉：静脉、肌肉
8、或腹腔内注射 麻醉剂：3%戊巴比妥等 适用对象：较大动物 缺点：内脏淤血,2、动物的致死方法,（2）空气栓塞：向动物静脉内注入一定的空气 适用对象：较大动物，如兔、犬 缺点：血管、内脏淤血,（3）断头：用剪刀剪去动物头部 适用对象：小动物，如青蛙、小鼠（4）其他方法：击头法、断髓法、股动脉放血法等,3、致死原则：,（1）选择合适的致死方法：利于取材和观察（2）快速致死，避免挣扎,4、取材注意事项,（1）根据实验目的选择动物的种类： 肝脏猪肝、胃狗、卵巢猫（2）组织材料要新鲜：在心跳未停时即取材固定。 神经系统：10秒钟变性 消化系统上皮：15分钟自溶 亚细胞：变性更快。,（5）组织块大小适宜：
9、结构完整，组织块：小、薄：1cm 1cm 0.2cm,最厚不能超过0.5厘米（6）修剪附带的其他组织,（3）选好部位和切面： 胃：胃底；胰腺：胰尾部； 肺：肺门 管性器官:横切，小肠环行皱襞:纵切 头皮:顺毛根纵切，肾脏:纵切（包括皮质和髓质）,（4）避免损伤组织： 避免手拽、有齿镊子夹、刀剪不锋利,（8）保持清洁：尤其是消化管 用生理盐水洗去血液、污物、粘液及食物残渣,（7）防止收缩变形,骨骼肌、神经在离体后：用木刺扎于木板上或将其两端用线捆于小棒上,（二）固定,1、概念：用化学试剂使蛋白质凝固或沉淀，保持其生活状态时的形态结构的过程。 固定剂（液）：用来固定的化学试剂。,2、目的（1）防止
10、自溶与腐败（2）维持形态：使细胞内物质凝固或沉淀下来，保存各种抗原成份原有的结构（3）利于切片：增加硬度（4）利于鉴别和观察：使细胞内成分产生不同 的折光率（5）利于染色：媒介作用，使细胞各部易于受色,3、固定剂,（1）固定剂的必备特性 渗透力强 迅速使组织及细胞成分凝固或沉淀,不致使组织过度收缩与膨胀,能使组织获得较佳的折光率,（2）固定剂的种类 按作用原理分： 凝固性：甲醛，重铬酸钾,沉淀性：酒精、升汞等,按化学性质分,还原剂：醛类、醇类氧化剂：锇酸、重铬酸钾酸类：苦味酸、醋酸,单一固定剂：一种试剂组成只对细胞的某种成分固定得较好，不能将所有的成分都保存下来,混合固定剂：两种以上的试剂组成
11、,按组成成分,（3）常用单一固定剂的性质及用法,名称,福尔马林,（甲醛）,性质概要,1、无色、刺激味的液体。还原剂，凝固蛋白质。2、保存脂类、糖，线粒体及高尔基体的固定剂。3、硬化剂，冰冻切片的优良固定剂。,对染色的影响,固定后的处理,硬化程度,其他,常用的单纯固定剂，对细胞的保存好。甲醛能与任何比例的水、醇及乙醚混合。,渗透速度及小块组织（2mm3）固定时间,较快412小时,适度,可入70%酒精或水冲洗,对苏木素着色好，对伊红着色困难。,收缩与膨胀情况,收缩较小，脱水会使收缩变大。,名称,性质概要,对染色的影响,固定后的处理,硬化程度,其他,渗透速度及小块组织（2mm3）固定时间,重铬酸钾,
12、1、橙红色结晶体，有毒、氧化力极强，能溶于水，不溶于醇，凝固蛋白质2、保存类脂体，线粒体的固定剂，溶解染色质。,较快，24小时,在切片技术中是良好的药品,收缩与膨胀情况,起初收缩不显著，组织经酒精脱水会继续收缩,中等,用水冲洗,对酸性染料着色很好,（4）混合固定剂的优点及配制原则,优点：取长补短原则：相互弥补 快+ 慢 胀+ 缩,(5)常用混合固定剂A、F液（酒精+ 甲醛）组成：无水酒精90毫升，40%甲醛10毫升特点：简单、皮下组织铺片、肥大细胞固定好、对弹性纤维、胶原纤维染色好,Carnoy液,组成：冰醋酸1份，氯仿3份，无水酒精6份,特点：快、用于糖原、神经细胞尼氏体、细胞内DNA、RN
13、A固定。,Bouin液,组成：饱和苦味酸水溶液，40%甲醛，冰醋酸。（15：5：1）,特点：常用，固定时间1224小时，适用于大多数组织，以细胞核、细胞分裂为好，对肾脏固定不好。现配现用,Zenker S液,组成：重铬酸钾2.5克，升汞5克，蒸馏水100毫升贮备液：棕色瓶保存，临用前加冰醋酸5毫升。,特点：常用，固定时间1224小时，水冲洗，加碘去汞，细胞核、细胞质染色好。,（5）固定的方法 灌注法：经血管途径将固定液灌注到所需要固定的器官（超微结构） 类型：心插管固定；股动脉插管灌注 浸泡法：组织直接浸泡在固定液中。 固定液的量：足够、组织块大小的1530倍，瓶底垫纱布 微波固定：固定的组织
14、收缩小 蒸汽固定：避免可溶性成分在固定液中丢失，对人危害大,（6）组织固定后的变化,体积改变：胀或缩,酒精、升汞、苦味酸 缩小,重铬酸钾、醋酸膨胀,硬度增加：酒精、甲醛增加多锇酸、苦味酸增加较少,抗张力增加,折光率增加着色性增加,（7）固定注意事项,标本大小适宜：组织块体积：1cm 1cm 0.2cm标本固定要及时最好在低温下固定,固定液的选择要合理,固定液配制要新鲜(除贮存液外，要现配现用）固定液的量要足够：组织块大小的1530倍，瓶底垫纱布。,固定时间适当：避免太长、太短。,固定后要彻底冲洗,（三）洗涤和脱水,1、洗涤,（1）目的,去除固定液，终止固定作用， 去除固定剂的重金属离子或颗粒,
15、（2）原则,什么配的固定剂就用什么洗（苦味酸固定的，用低浓度乙醇洗），固定剂为酒精或酒精混合液可不洗,洗涤时固定时,特殊成分加特殊洗涤剂：脱黄（70%乙醇），碘酊脱贡（固定液含升汞的），硫代硫酸钠脱碘,2、脱水,（1）概念：用化学试剂将标本中的水置换出来的过程,（2）目的： 利于浸蜡（水不能与石蜡等包埋剂混合）,利于组织的永久保存（水使组织分解）,（3）脱水剂,脱水剂的特性,与水任意混合，也能与透明剂混合的液体,脱水剂的类型,单纯脱水剂如：酒精、丙酮等脱水兼透明的脱水剂如：正丁醇等最常用：酒精，缺点：组织硬化和变脆（尤其是高浓度酒精）。,（4）酒精脱水,原则：,循序渐进，酒精浓度逐步增大,柔软
16、组织、胚胎组织:30%开始,暂不包埋的组织:70%80%的酒精保存更换乙醇:吸水纸吸去组织块表面的水,脱水时间：组织种类、体积大小而定 (一般624小时）,（四） 透明,2、目的：便于浸蜡包埋,1、定义：用一种既可与脱水剂相容又能和 石蜡相容的物质置换脱水剂，组织块呈现透明状态。,3、透明剂：透明所用的药剂,透明剂：,苯、甲苯、二甲苯、香柏油、丁香油等,常用：二甲苯、香柏油,（1）二甲苯,优点：透明力强，作用快。,缺点：容易使组织收缩、变硬、变脆。,注意：先经1/2纯酒精+1/2二甲苯混合液过度，再进二甲苯，二甲苯 （可通过肉眼观察来决定时间）。透明过度,组织变脆,切片时易破碎,（2）香柏油,
17、优点：组织收缩及硬化小,缺点：慢，12小时以上；香柏油透明后需浸二甲苯（因不易被石蜡取代）,问题：如果组织块在透明时，呈白色浑浊不透明状态，是何原因？,答：脱水不彻底所致。,（五）浸蜡与包埋,浸蜡：支持剂石蜡透入组织内部，置换透明剂的过程。,1、浸蜡目的 置换透明剂，将软组织变为蜡块，以便切片。,软蜡软蜡硬蜡硬蜡,30 40分钟30 40分钟,20 30分钟20 30分钟,2、浸蜡过程,3、浸蜡注意点,选用适当熔点的蜡：南方硬蜡，北方软蜡 冬软，夏硬,充分透入要使石蜡完全渗入细胞的每个部分,浸蜡时间不能太长，烤箱温度不可太高，否则组织收缩变脆。,4、包埋：浸透石蜡的组织块入新的石蜡中冷却凝固。
18、,包埋：硬蜡,（1）包埋剂,石蜡：最常用，类型（熔点不同）：软蜡和硬蜡。软蜡：熔点50 ，硬蜡：熔点50 ,（2）材料：L形金属包埋框，玻璃底版、酒精灯、小镊子,（3）包埋中注意要点,小尖镊不时烤热标本切面方向朝下，标本间要有一定的距离动作快快速冷却：石蜡表面凝固，立即放入冷水中,（4）包埋后可能出现的问题,组织内空泡：脱水或透明或浸蜡不够。组织外空泡：包埋动作太慢。,有空泡,（5）标本分块修切蜡块：正面：正方形或长方形，两边两两平行。标本四周:1-2mm宽的石蜡侧面：梯形,1、切片前玻片的处理,（六）切片,2、切片机,分类轮转切片机（本室常用）刀固定，材料前进，主要用于石蜡切片,主要构造载物
19、台持刀架 切片厚度调整器,推拉式切片机,材料固定，刀移动,主要用于火棉胶切片,（2）切片注意事项： 刀片:锋利，切片机的螺丝:旋紧。 组织块的切面和切片刀间的夹角:5。 切片速度:均匀 石蜡切片正面朝上放（与刀片接触的面为反面）,（3）石蜡切片中常遇的问题及解决办法,蜡带变弯,刀锋锐不一致，蜡块四方不对称，蜡块与刀口不平行。,移动刀口位置，修整蜡块，调整刀或蜡块 。,蜡带上卷,刀不利，斜度大，蜡片太厚，蜡边留太少，硬度过大，室温过低。,磨刀，调刀角度，调片厚度，重包，加温。,蜡片起皱,刀不利，斜度过小，刀口不洁，蜡太软，室温过高。,磨刀，调刀角度，二甲苯擦，冰冻，降温。,蜡片有裂痕或划破,刀有
20、缺口，蜡中有气泡或沙粒。,移动刀口位置，包埋前去气，滤蜡,问 题,原 因,解 决,组织与蜡分离,脱水、透明、浸蜡不够。,退回，选择适当时间。,蜡片厚薄不一,推进装置失灵，夹具松动，蜡块过大。,修理切片机，上紧夹具，取材宜小。,问 题,原 因,解 决,切片脆烂,高浓度酒精，透明, 浸蜡太久，蜡温过高。,无法弥补，控制蜡温和浸蜡时间 。,（4）石蜡切片的详细过程,详细过程,步骤 本室 参考 时间 取材,固定 24小时左右,洗涤 等于固定时,脱水：70%酒精 612小时,80%酒精 48小时,95%酒精 24小时,95%酒精 24小时,100%酒精 12小时,100%酒精 12小时,1/2 纯酒精+
21、1/2二甲苯 2030分钟,透明：二甲苯 1530分钟,二甲苯 1530分钟,浸蜡： 软蜡 3045分钟,硬蜡 3045分钟,包埋,切片,贴片（温水捞片）,烤片（370C过夜）,（七）脱蜡和水合:脱蜡:二甲苯脱去石蜡切片的蜡，两次水合（水化、下行入水）：酒精浓度：逐步降底100%酒精95%酒精80%酒精蒸馏水,（八）抗原修复,1、原因：甲醛使蛋白质发生凝固，分子间会发生交联2、目的：抗原再现,3、方法：酶消化、热诱导的抗原修复,（1）热诱导的抗原修复： 定义：高温、高压对石蜡切片进行抗原修复或复原。,修复方式：a微波 b煮沸 c高压锅。,（2）酶消化：去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白 断交联,
22、蛋白酶的种类0.05%0.1胰蛋白酶：细胞内抗原0.4%胃蛋白酶：细胞外基质内抗原,（九）封闭,原因:蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上,解决办法: 滴加第二抗体来源动物之非免疫血清 抗体稀释液中加入牛血清白蛋白,1、滴加抗体：抗体浓度要合适的,2、温育时间: 370C, 3060分钟, 湿盒中 ；40C,过夜，呈色,（十）免疫染色,（十一）复染（1）目的：将机体组织细胞染上颜色，衬托出组织形态结构。（2）部位：染细胞核（3）复染剂：苏木素、甲基绿、核固红,（4）染料（复染剂）的特性,有颜色与被染组织有亲和力,发色团：产生颜色的原子团助色团：使染料对组织有亲和力的原子团。,发色团：硝基、亚
23、硝基、偶氮基、羰基、烯基、醌型苯环,发色团多的染料，颜色深,助色团：,有色物：只有颜色，无亲和力,染料的分类,根据来源分类,天然：苏木素（植物），胭脂红（动物胭脂虫）人工合成：苦味酸，偶氮染料,根据化学反应分,酸性染料碱性染料,酸性染料：酸性助色团（ COOH，SO3H等），带负电荷。伊红,碱性染料：碱性助色团（NH2、 NCH3等），带正电荷。美兰、苏木素,中性染料：酸性、碱性助色团。瑞氏粉、姬姆萨,根据染色对象分,胞核染料：苏木素，胭脂红胞浆染料：伊红、苦味酸脂肪染料：苏丹、，油红O,（5）染色原理,物理和化学综合作用,物理作用：,渗透作用：不牢固,吸附作用： 分子引力作用，色素粒子被吸附
24、,吸收作用：牢固,化学作用,细胞主要成分：蛋白质,含,NH2 与酸性染料（带负电荷）,COOH 与碱性染料（带正电荷）,（碱性）,（酸性）,细胞核（酸性物质多）：与碱性染料亲和力强,细胞质（碱性物质多）：与酸性染料亲和力强,（十二）分化与封藏,1、分化（分色）概念：把过染的部分褪至适当的程度，去掉不应着色的颜色。,对苏木素染色的组织分色:用0.51%的盐酸酒精。,分化剂（脱色剂）: 脱去切片上过染的颜色的试剂以酸褪碱性染料，以碱褪酸性染料（含碱的自来水）,2、封藏（固）（1）目的 防止退色、受潮、干裂及磨损等，使切片永久保存,（2）常用封藏（固）剂,干性（常用）：保存时间长，封固前：须脱水、透
25、明中性树胶（液态或固态） 便宜加拿大树胶（固态） 较贵香柏油 凝固太慢,水性：,甘油：液态，图象清晰度不佳甘油明胶：固态，凝固性,不需脱水、透明，保存时间短,（3）封固注意事项： 树胶不能搅拌 树胶量要合适 标本表面二甲苯不能挥发干 盖玻片大小适宜：标本周围留2mm空白 封片时都避免产生气泡,（十三）免疫组化结果的观察和记录,2、对照,(1)阳性对照: 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫染色,对照切片：阳性,(2)阴性对照:用已知抗原阴性的切片与待检标本同时染色,对照切片：阴性.(3)空白对照(替代对照): 用抗体稀释液替代第一抗体,结果：阴性.,(4)自身对照：同一标记切片上的自身组
26、织成分的阴性背景对照。结果：阴性或着色较浅目的：排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。,3、染色失败的原因,（1）全部切片都为阴性： 漏加一种抗体或抗体失效； 底物中过氧化氢量少或失效； 缓冲液中加叠氮钠，抑制酶活性； 复染使用不当,（2）所有切片均为弱阳性 抗体过浓或干燥； 抗体温育时间过长； 呈色底物液变色或反应时间过长； 过氧化氢浓度过高，成色速度过快； 洗涤不彻底；黏附剂太厚,(3)所有切片背景过深,切片或涂片过厚蛋白质封闭不够或所用血清溶血使用全血清抗体稀释不够底物成色反应过久漂洗不够,（4）阳性对照染色良好,检测的阳性标本呈阴性：固定处理不当,4、结果分析：,免疫组织化学石蜡切片制作程序小结,取材 固定 洗涤 脱水 透明 浸蜡 包埋 切片 贴片 脱蜡 下行入水 染色 复染 脱水 透明 封片 观察记录,（免疫）,解答问题：来自丁香园论坛中1.我研究的因子是核蛋白，但是免疫组织化学做出来却是在胞浆表达，这是什么原因啊。求高手指教！,3.各位见帖好:兄弟在做大鼠脑缺血5天后，bFGF表达的免疫组化， 但，无奈，背景非常深，几乎看不出阳性细胞的颜色 请高手们指点，谢谢,2.大家好，我做了免疫组织化学的实验，但就是不显色，刚开始以为是一抗的原因，但是后来又换了一坑，但还是不显色，这最可能是什么原因呢？先谢谢啦,
