1、流感病毒实验室检测技术及盲样考核结果分析,湖南省疾病预防控制中心微生物检验科黄一伟2013-12-27,流感监测目的,（一）监测流感活动水平和流行动态；（二）及时发现流感病毒变异并作出预警；（三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。,流感监测内容,（一）流感样病例监测（二）流感样病例暴发疫情监测,流感样病例监测标本采集,采集对象： 流感样病例 发热（体温38），伴咳嗽或咽痛之一者采集时间：病人发病的头3天内采集采集地点：国家级流感样病例监测哨点医院采集数量：根据就诊ILI病例数的多少，每家哨点医院每周至少采集515份流感样病例的标本(根据流行季节、流行强度、防控工作需要实时调整）,暴
2、发疫情标本采集,（1）1周内，在同一学校、幼儿园或其他集体单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联的死亡病例；（2）在某一社区内（如同一乡或街道）1周内出现流感样病例异常增多。每一起暴发疫情一般应当采集10份左右咽、鼻拭子标本（如果现症病例在10例以下的，应当尽量全部采样）。,采集标本类型,常规特殊咽拭子 鼻咽/呼吸道吸取物鼻拭子 鼻洗液痰液 呼吸道灌洗液 肺组织活检标本 尸检标本,采样液,常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hanks液或MEM；标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，同时加入抗菌素（入庆
3、大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL ）,咽拭子采集,咽拭子 用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。,标本的保存与运送,标本采集后应在4条件下，尽快（哨点监测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网络实验室未能送至实验室的，应置-70或以下保存，一周内送实验室冻存的标本，尽量避免其反复冻融，在冷藏条件下送到实验室,实验室生物安全要求,季节性流感病毒分离鉴定在生物安全级实验室进行。流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物安全级实验室的生物安全柜里操作。用灭活
4、的抗原进行血清学检测时可以在生物安全级实验室进行,标本的接收,接收标本时必须核对送检表流感监测网络实验室的工作人员接到标本后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例标本原始登记送检表”（表2）录入到“监测信息系统”,标本的处理,标本送至实验室后，立即进行处理，未加抗菌素的加入适量的抗菌素。将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于MDCK细胞接种，一份（1ml）用于鸡胚接种，一份（1ml）保存待复核。（根据检测程序实时调整）,实验室检测,核酸检测病毒分离和鉴定：鸡胚分离和细胞培养胶体金快速检测,检测流程,临床标本采集,接种MDCK细胞,接种鸡胚,红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒,红细胞凝集试验,寄送国
5、家流感中心,流感病毒核酸检测阳性,核酸检测,核酸提取- QIAamp Viral RNA Mini Kit1）在1.5ml 离心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）140ul加入上述离心管中（粪便标本用10悬液的上清），震荡15s，室温放置10min。3）稍离心后，加入560ul无水乙醇，震荡15s。4）将Viral RNA Mini spin柱子取出，将步骤3的混合液吸取630ul加入柱子中，8000rpm离心1min。弃离心液。5）重复步骤4。6）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8
6、000 rpm离心1min。弃套管及其离心液。7）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液，13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。8）将吸附柱放入一新的1.5ml 离心管中，于柱中加入60ul的AVE液，室温静置13分钟，8000rpm离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即实验或20以下保存。,荧光定量PCR,第一次使用前引物稀释1引物工作浓度（40M）配制方法：（1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNase Free Water溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100M，可作为储存液。（例如：假设
7、合成引物每管2OD，若2OD的量为9.1 nmol ，加水量为109.191l）（3）将100M的引物2.5倍稀释，此时浓度为40M，可作为工作浓度。2探针工作浓度（10/20M/）配制方法：（1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNase Free Water溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100M，可作为储存液。（3）将100M的探针10/5倍稀释，此时浓度为10/20M，可作为工作浓度。,荧光定量PCR,引物和探针稀释好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；涡旋振荡引物和探针；瞬时离
8、心引物和探针，之后置于冰架上。real-time RT-PCR的试剂QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443 注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。,荧光定量PCR,反应体系和条件试剂：Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step Quantitative Kit （公司： Invitrogen，货号：11732-020或11745-100）分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)正反向引物 (40M)双重标记探针(10M)反应条件：逆转录50 30min95 2min
9、（95 15s 55 30s*）45反应体系为25ul注：*在55 度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）,荧光PCR结果阳性样品,荧光PCR结果阴性样品,荧光PCR结果可疑样品,病毒分离-MDCK细胞,标本接种MDCK细胞,每日观察细胞病变(CPE),MDCK细胞收获,3335培养,接种流程,清洗MDCK 细胞,临床采样标本接种细胞,Hanks液清洗细胞，一般清洗2遍,3335度吸附12小时,Hanks液清洗细胞,加入病毒生长液，3335度培养箱培养,24小时后，观察细胞病变。当细胞病变为3+或4+时，即75100%细胞出现病变时进行收获，收获之前将细胞冻融12次，以提高收获标本的病毒滴度。即
10、使无细胞病变也应该于第7天收获 （细胞病变情况：细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落 ）,根据使用的细胞瓶的大小，决定接种量，一般的小细胞瓶接种0.5ml的临床标本,流程图,MDCK细胞病毒分离,CPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性有关每日观察细胞病变(CPE)标本接种后7天还未出现CPE，维持液经HA试验阴性者，继续盲传12代后，HA试验仍为阴性者，则MDCK细胞病毒分离为阴性，标本可弃去,细胞病变图,鸡胚病毒分离,标本接种于9日龄鸡胚,3335培养72小时,检卵,标本准备,鸡胚分离方法-试剂准备,1
11、) 911日龄鸡胚2) 照蛋灯3) 70%75酒精4) 1ml 一次性注射器5) 鸡蛋开孔器6) 无菌胶布或蜡7) 10ml 试管和试管架8) 10ml 移液管或1ml移液器及无菌吸尖9) 无菌镊子10) 无菌眼科剪,鸡胚分离方法-标记鸡胚, 检视标记鸡胚 用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部的位置 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉, 接种病毒方法 单腔接种 盲种
12、双腔接种 灯下接种 开窗接种,鸡胚分离方法,鸡胚分离流程（1）,将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，通常每个样本接种3个鸡胚 用70%75酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10x6mm窗口 用注射器吸200l处理过的临床标本，装上16 号针头 从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即 可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的 鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100l标本。将针头退出至 寸，将另外100 l标本 注入鸡胚尿囊腔,鸡胚分离流程（2）,用同一注射器和针头将同一标本依上法接种
13、另外的两枚鸡胚将针头弃于合适的生物安全装置中用消毒过的医用胶布封口 3335oC 温箱培养鸡胚23 天。临床采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天 鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去,鸡胚分离流程（3）,收获尿囊液和羊水鸡胚在收获前应4过夜或至少放置4小时标记15ml 无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致用70%75酒精消毒鸡胚顶部用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用10ml 吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并,鸡胚病毒鉴定,经HA试验阴性者
14、，将羊水和尿囊液混合，继续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚病毒分离为阴性，标本可弃去,鸡胚收获,HA试验,病毒鉴定,红细胞凝集红细胞凝集抑制试验,病毒鉴定流程,红细胞凝集试验,4个凝集单位配制“回滴”,红细胞凝集抑制试验,判定流感病毒型别,红细胞凝集试验（HA）,MDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验（HA），确定病毒滴度 原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，
15、可以抑制凝集现象出现,A,H,B,C,D,E,F,G,100ul病毒液,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,50ul,稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液,50ulPBS,稀释病毒加入配制好的红细胞悬液充分混匀，置室温孵育30-60分钟观察记录结果,病毒原液,1：2,1：128,HA： 32,HA128,HA： 4,红细胞凝集试验（HA）,HA滴度8，进行红细胞凝集抑制（HI）试验；HA滴度8者，继续在敏感的MDCK细胞系或鸡胚上进行传代培养，使其HA滴度8后，再进行HI测定若传12代后，HA滴度仍8者，可应用核酸检测方
16、法进行鉴定,红细胞凝集抑制（HI）试验,HA试验完成后，用国家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Yamagata系）4种标准参照血清，进行红细胞凝集抑制（HI）试验，确定病毒的型别和亚型，进行HI试验时，需同时进行4种标准抗原对照。,红细胞凝集抑制试验步骤,4个凝集单位的配制和检测稀释血清加入25ul 4个血凝单位抗原，室温孵育15-30分钟每孔加入50ul红细胞悬液，充分摇匀。室温孵育30-60分钟观察记录结果,4个凝集单位的配制和检测,4个凝集单位的配制读取红细胞凝集试验的结果计算所须的4个凝集单位的病毒用量用50ul检测4个凝集单位时
17、，用凝集效价除以8，所得商即为4个单位的稀释度用红细胞凝集试验“回滴”，复核4个凝集单位用50ul，前4孔完全凝集 。此时的抗原即为4个凝集单位,红细胞凝集抑制试验稀释血清,1,2,7,6,5,3,4,9,8,10,H1血清50ul,H3血清50ul,50ulPBS,B血清50ul,25ulPBS,25ul,25ul,25ul,25ul,25ul,25ul,25ul,25ul,B血清50ul,H3血清50ul,H1血清50ul,流感病毒的型别判定,标准参照血清对待鉴定病毒的抑制效价20才可以算为阳性 一个待鉴定病毒不能同时被两种或两种以上的标准血清抑制待鉴定病毒与标准参照血清有交叉抑制，但与一
18、种标准参照血清抑制效价大于其他参照血清4倍以上时，可以判定为此型别的流感病毒,红细胞凝集抑制试验-质量控制,使用的试剂可靠无误处理后的血清有无残余非特异性凝集素读取HA试验的结果是否正确4个血凝单位是否准确红细胞阴性对照待鉴定病毒确保没有被细菌污染稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确,结果录入,流感监测网络实验室的工作人员在完成病毒分离后，24小时内将病毒分离结果录入“监测信息系统”中的“病毒分离、鉴定结果登记一览表” 中 。,毒株的送检,系统自动生产的送检单，省里和国家均送检时限要求包装要求,省级参比中心,开始启动,9个（30%）省级CDC建成省级流感参比中心80 %网络实验室开展病毒分离,
19、2009-2013年度全国网络实验室工作开展情况,80.1%,2010-2013年度全国网络实验室盲样考核情况,97.5%,93.2%,96.0%,2010-2013年度全国网络实验室标本检测结果,省级流感参比中心工作要求,省级流感参比中心工作要求,参比中心近期要求,成为参比中心4年内，所有流感网络实验室均具备病毒分离能力，并上送毒株省参比中心的毒株复核鉴定工作各实验室毒株在网上送检时需要多点一下送省里毒株,国家流感中心,省CDC,10个工作日内完成复核鉴定,滴度8的型别鉴定，滴度8核酸鉴定，每周一在系统中反馈结果,质控考核-考核标本,考核标本制备：14份H1N1，14份H3N2，14份 BV， 10份H5N1，7份H7N9，10份阴性7份BY和H3N2混合型4份H1N1，H3N2，BY混合型每个地市随机抽取5份标本,质控考核-新的要求,增加混合型B型要求分系考虑到运输问题，均为强阳性,质控考核-结果,14家网络实验室结果全部正确一些问题：原始记录应为手写，而非全部打印+签名原始记录空白项、涂改项有一地市为非正式的报告单，报告人未签名，报告处未盖章,祝各位代表工作顺利、生活愉快！,
