1、第十七章病毒检验技术,本 章 内 容,学习目标及重点,学习目标： 掌握病毒标本采集和送检应遵循的原则；病毒检验鉴定常用技术熟悉病毒血清学诊断常用的方法了解病毒感染的实验室快速诊断学会病毒的培养基本操作本章重点： 病毒标本采集和运送原则。病毒学诊断及鉴定常用方法。病毒培养的基本操作。,病毒学检验技术是用实验室检验方法对临床和流行病学现场送检的标本（如人或宿主的血液、组织、尿、粪便和组织液等）进行病毒学的定性和定量分析，为病毒感染和病毒性疾病的诊断、治疗和预防提供科学依据。检验程序包括标本的采集、分离培养鉴定、快速诊断。,第一节 标本的采集、处理与运送,一、标本的采集与处理1. 采集时间：发病早期
2、或急性期尽快采集。很多急性病毒感染，症状出现前病毒已经开始释放，症状初期病毒量即迅速达到峰值，之后平缓下降至疾病痊愈，不过也有例外。,第一节 标本的采集、处理与运送,一、标本的采集与处理2.采集部位：取决于临床症状和所怀疑感染的病毒。从病原体入侵部位取材从病原体感染的靶器官取材根据病原体的排泄途径取材从环境中采集标本 如：流感病毒感染-鼻咽拭子 乙型脑炎病毒感染-脑脊液 轮状病毒感染-粪便 乙型肝炎病毒感染-血液,第一节 标本的采集、处理与运送,一、标本的采集与处理3.采集方法与处理 提高病毒的分离率，防止标本污染。,采集时无菌操作,可加入抗生素以杀死杂菌,二、标本的运送与保存 1.标本的运送
3、尽快送检冷冻、冷藏运输防漏、专人、标记2.标本的保存-70可较长时间保存可加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）、Hanks液或小牛血清等以防病毒失活,第一节 标本的采集、处理与运送,不同的病毒分离时采用不同的分离方法,这主要取决于目的病毒的生物学特性。主要有细胞培养法、鸡胚培养法、动物接种法等,而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。,第二节 病毒的分离与鉴定,一、 病毒的分离培养 2.鸡胚培养,第二节 病毒的分离与鉴定,原代细胞培养二倍体细胞培养传代细胞,羊膜腔接种尿囊腔接种卵黄囊接种绒毛尿囊膜接种,组织细胞培养,鸡胚培养,动物接种,是将离体活组织块或分散的组织细胞
4、加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。,（一）组织细胞培养,鸡成纤维细胞,Hep-2细胞,细胞培养瓶,Vero细胞,第二节 病毒的分离与鉴定,1.原代细胞原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞。原代细胞的培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。2.二倍体细胞是指原代细胞在体外分裂50代以后仍能保持其二倍染色体数目。二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。,3.传代细胞传代细胞来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程中变异的细胞称为传代细胞，它
5、们能在体外无限期地传代。大多是肿瘤细胞或突变的二倍体细胞。常用的传代细胞株有Hela细胞（人宫颈癌细胞），Hep-2（人喉上皮癌细胞）、Vero（非洲绿猴肾细胞）等。,15,2.鸡胚培养,第二节 病毒的分离与鉴定,鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。,16,一般选用914d的鸡胚,来源充足、组织分化程度低、本身很少携带病毒和细菌、对接种病毒不产生抗体及病毒较易增殖等,2.鸡胚培养,优点：,第二节 病毒的分离与鉴定,选择不同的接种部位是病毒分离成功的关键常用的主要有： 尿囊腔接种、羊膜腔接种
6、、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种,2.鸡胚培养,第二节 病毒的分离与鉴定,不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异很大,2.鸡胚培养,尿囊腔接种,羊膜腔接种,尿囊腔,羊膜腔,常用接种途径： 尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种,常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养,常用于临床流感病毒初次分离,第二节 病毒的分离与鉴定,卵黄囊接种,绒毛尿囊膜接种,卵黄囊,绒毛尿囊膜,人工气室,2.鸡胚培养,主要用于虫媒病毒、衣原体及立克次体的分离和繁殖。,常用于牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离,卵黄囊,第二节 病毒的分离与鉴定,3.动物接种,常用的实验动物有小白鼠、乳鼠、豚
7、鼠、家兔、猴和鸡等常用的接种途径包括皮下、皮内、腹腔、静脉、角膜、鼻腔及脑内接种等方式,第二节 病毒的分离与鉴定,二、病毒增殖的观察（一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1细胞形态的改变 2红细胞吸附 3细胞培养液pH值改变（二）病毒数量及病毒感染性测定 1血凝试验 2中和试验 3空斑形成试验 4半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50）,第二节 病毒的分离与鉴定,二、病毒增殖的观察（一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1细胞形态的改变 （1） 细胞病变效应（cytophathic effect，CPE）,第二节 病毒的分离与鉴定,正常细胞 病变细胞,是指某些病毒特别是无包膜的病毒感染
8、组织细胞后，正常生长的梭形细胞变圆、变性、坏死、溶解及从培养瓶壁脱落，细胞堆积形成葡萄状,第二节 病毒的分离与鉴定,（2）多核巨细胞,1细胞形态的改变,多见于有包膜的病毒，如呼吸道合胞病毒、麻疹病毒等，由感染细胞融合而成多核巨细胞,第二节 病毒的分离与鉴定,（3）包涵体,1细胞形态的改变,某些病毒感染宿主细胞后，细胞内出现一种光学显微镜下可见的蛋白质结构，多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成，称为包涵体。,第二节 病毒的分离与鉴定,2红细胞吸附有些病毒感染细胞后,细胞膜上可镶嵌着病毒基因编码产生的糖蛋白,其中有些能吸附特定种类的红细胞,或将细胞培养单层刮
9、下后,经过适当处理,可以凝集特定种类的红细胞,此类糖蛋白在细胞表面形成刺突,称为血凝素。3细胞培养液pH值改变,二、病毒增殖的观察,病毒感染细胞后，可使细胞的代谢发生变化，导致培养液pH值改变。,第二节 病毒的分离与鉴定,（二）病毒数量及病毒感染性测定,二、病毒增殖的观察,1血凝试验,病毒颗粒,红细胞,某些病毒（如流感病毒）表面的血凝素（HA）能引起人或某些哺乳动物的红细胞发生凝集，将这类病毒感染细胞后收集的病毒液作不同稀释，以发生血凝反应的病毒液的最高稀释度作为该病毒的血凝效价（即滴度），可对病毒含量进行半定量测定。,血凝现象,第二节 病毒的分离与鉴定,能使红细胞完全凝集的病毒的最高稀释倍数
10、为该病毒的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）,第二节 病毒的分离与鉴定,病毒液中若先加入病毒的特异性抗体，抗体与病毒表面的抗原特异性结合，从而抑制病毒与红细胞的血凝现象，称为血凝抑制试验。,第二节 病毒的分离与鉴定,2中和试验（Nt） 在体外孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，经培养后观察CPE或红细胞吸附现象是否消失，即特异性抗体是否中和相应病毒，从而测定残存的病毒感染力的一种方法,3空斑形成试验,第二节 病毒的分离与鉴定,是一种检查和准确测定病毒滴度的方法。将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂
11、，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的空斑/蚀斑(plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作空斑形成单位 (plaque forming unit, PFU)。病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。,4半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50）,测定病毒感染鸡胚、动物或细胞后，引起50%死亡或病变的最小量。用来估计病毒感染的强弱程度，但不能准确测定感染性病毒颗粒的多少,第二节 病毒的分离与鉴定,第三节
12、病毒学检测及诊断,一、形态学检查及诊断 1. 光学显微镜检查： *直接观察到较大的病毒体（如痘病毒） *包涵体 狂犬病毒感染-嗜酸性包涵体 巨细胞病毒感染-“猫头鹰眼”状的嗜酸性包涵体,2. 电子显微镜检查： *透射电子显微镜 用于观察病毒的大小、形态与结构及细胞内的超微结构等*扫描电子显微镜： 用于观察病毒和细菌表面结构和附属结构等,一、形态学检查及诊断,扫描电子显微镜,第三节 病毒学检测及诊断,第三节 病毒学检测及诊断,（1）标本制备,超滤法超速离心法接种细胞快速增殖法免疫凝集法,（2）常用观察方法 负染色法 超薄切片法 免疫电镜法,病毒颗粒具有亮度，在周围较暗的背景上显示亮点,过程与病理
13、切片过程相似,免疫组织化学与电镜技术的结合,透射电子显微镜,第三节 病毒学检测及诊断,二、血清学检测及诊断 原理：用已知的病毒抗原检测患者血清中的抗体水平或 用已知的病毒抗体直接检测标本中的病毒抗原1.病毒抗原的检测：用荧光素、酶或胶体金等标记物标记病毒抗体检测标本中的相应病毒抗原。如ELISA检测HBsAg,第三节 病毒学检测及诊断,2.病毒抗体的检测：已知病毒抗原多数为通过基因工程技术制备的重组抗原，其次是从患者标本中分离纯化的抗原。检测抗体的类型确定患者所处感染阶段-急性期单份血清的IgM测定是诊断原发感染和早期感染-IgG含量的测定应取病人急性期和恢复期双份血清，若含量升高4倍以上表明感染病毒,第三节 病毒学检测及诊断,三、分子生物学检测及诊断1.核酸分子杂交技术 2.聚合酶链反应（PCR）-多种病毒的快速诊断3.基因芯片技术-如检测H1N1甲型流感病毒4.基因测序-如病毒耐药基因型的检测,第三节 病毒学检测及诊断,
