1、1外敷中药复方对促进骨折愈合的体外实验研究彭丽华，高俊熙，萧永沁，梁秉中 *(香港中文大学中医中药研究所)摘要：骨折损伤至愈合是一个包括多种细胞和组织代谢的复杂过程，可被多种因素干扰。各种原因导致的骨折延迟愈合、不愈合约占骨折病人的57。寻找有效的方法加速损伤愈合一直是骨科研究的热点。传统医学运用中药治疗骨折损伤，历史悠久，疗效显著。但是在有关方剂的药效和机理方面一直缺乏系统的研究。本课题旨在利用现代生物模型，验证中药方剂对骨折愈合的影响，为中医接骨理论提供科学依据和筛选新型方剂。根据中医骨伤的组方原则，本研究从抗炎镇痛，活血化瘀和接骨续筋三类中药中各选出两味最常用的中药，采用均匀设计法将六位
2、中药按照不同剂量配比，组成五条方剂。选择炎症因子(NO)释放、人体静脉上皮细胞(HUVEC-12) 和成骨细胞 (UMR-106)增殖试验分别反映抗炎镇痛，活血化瘀和接骨续筋的功效，测试各方剂对骨折愈合的影响。结果表明，五组复方体外试验均表现出单重或多重促进骨折愈合的作用。其中五号复方（大黄30克，栀子，三七，红花各9克，接骨木30克，续断15克）显示出全面的抑制NO释放，促进HUVEC-12和UMR-106增殖的活性。研究结果证明了中药复方能从多个方面加速骨折愈合，其主效应包括抗炎镇痛，促进骨折局部的血液循环和新骨再生。研究提供了以大黄、栀子为解毒君药，以三七、红花活血化瘀作臣药，续断、接骨
3、木为佐使的基本外敷复方，实际应用时可根据辩证观察作适当增减，达到最佳疗效。关键词：骨折愈合，中药复方，均匀设计，细胞试验Creating a Herbal Formula for Topical Treatment of Bone FracturesAbstract: Fracture healing is a process that involves the proliferation and differentiation of cells and tissues and can be stimulated by drugs. Traditional medicine has a rep
4、utation in the therapy on bone fracture. It is believed that herbal formulae promotes bone repair through multiple functions of “anti-inflammation”, “promoting blood circulation” and “stimulating bone formation”. This study aims to 2engineer a herbal formula under the guidance of Chinese medicine th
5、eories, then define the effective dosage ratio between the herbs and demonstrate the biological effects of the formulae on different parameters of healing using relevant in vitro assays. Six herbs which are frequently used for fractures were combined into five formulae according to the “Uniform Desi
6、gn” method. Assays of nitric oxide (NO) inhibition in mouse macrophages, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and rat osteoblasts proliferation were used to reflect the “anti-inflammation inflammatory”, “circulation promotion” and “bone formation stimulation” functions. The results showed
7、that all the formulae expressed significant activities of NO inhibition, and HUVEC cell and osteoblasts proliferation. Formula 5 with the largest doses (containing 30g Radix et Rhizoma Rhei, 9g Fructus Gardeniae, 9g Radix et Rhizoma Notoginseng, 9g Flos Carthami, 30g Ramulus Sambucus Willamsii, 15g
8、Radix Dipsaci) demonstrated the best results in all the three assays.Key words: Fracture healing; Herbal formulae; Uniform design; Cell assay* 通讯作者梁秉中 教授香港中文大學中醫中藥研究所所長香港 沙田 威爾斯親王醫院公共衛生學院大樓五樓中醫中藥臨床研究中心電話: 852-22528868傳真: 852-26325441電郵: pingcleungcuhk.edu.hk梁秉中教授的學術研究領域包括：骨科、骨質疏鬆、顯微外科、公共衛生、中醫藥及通識教育等
9、。梁教授曾於期刊撰寫超過三百份關於科學的論文，亦是十七本書籍的作者。另外，梁教授自一九八二年至今，曾擔任十一本國際醫學雜誌的編輯。31. 前言传统中医认为，骨折损伤的治疗大致可以分为三个阶段，早期需以清热祛毒药抗炎止痛，缓解各种红，肿，热，痛并发症；中期应重用活血化瘀药以促进血液循环和新骨再生；后期利用接骨续筋药滋补肝肾，强筋接骨，以促进骨折的完全愈合和功能恢复。中医的常规治疗包括使用局部外敷膏药，然后按症候转变，加以内服方剂治疗。本研究目的是寻求适当外敷用药，同时证实外敷确能透过外皮进入损伤范围，产生疗效。根据以上原则，将中药进行加减配伍，已有大量方剂被记载用于临床骨折的治疗 1。本研究查阅
10、大量中医古籍和现代文献，选出大黄，栀子作为清热解毒君药；三七，红花作为活血化瘀臣药；接骨木，续断作为佐使组织愈合的药材，以均匀设计法配比药材用量，组成外敷复方2-7。考察复方抗炎止痛，活血化瘀和接骨续筋的功效，优化剂量配比，并为中医骨伤理论提供科学依据。2. 材料与方法2.1 复方均匀设计与药材的提取实验所用中药材均购于安徽亳州芳益堂药材有限公司，所购药材经显微和TLC鉴定均为药用品种，质量合格。药材均留样于香港中文大学中医中药研究所 (药材编号：大黄，20073031；栀子，20073032；三七，20073033；红花，20073034；续断，20073035；接骨木，20073036)。
11、将复方中三组不同功效中药的剂量设为待考察的三因素(功效相同的两味中药设为同一考察因素)，将中国药典所提供的各药材的剂量范围8等分成五水平(同一因素内的两药材剂量取同等水平)，选定均匀设计三因素五水平设计表U 5(53)安排实验9，得到五种配方(表1) 。 将五组配方的药材分别用4倍体积的蒸馏水和95%乙醇加热回流提取，离心，取上清液真空浓缩并冷冻干燥，得到收率为17和4的水提物和醇提物干粉备用。 4表1 均匀设计U 5(53)实验安排表No1530999305 915668.2523.254 10.518.75337.516.53122.57.57.56.759.752 13.526.254.
12、54.5631 续 断接 骨 木红 花三 七栀 子大 黄接 骨 续 筋 药剂 量 /g活 血 化 瘀 药剂 量 /g清 热 抗 炎 药剂 量 /g 续 断接 骨 木红 花三 七栀 子大 黄 接 骨 续 筋 药剂 量活 血 化 瘀 药剂 量清 热 抗 炎 药剂 量2.2 细胞培养和细胞毒试验小鼠巨噬细胞系RAW264.7, 大鼠骨肉瘤细胞系UMR-106，和人体静脉上皮细胞系HUVEC-12购自美国模式培养物集存库 (ATCC, 美国)。RAW264.7和UMR-106以DMEM培养基 (含 10胎牛血清、青霉素100 kUL-1、链霉素100 kUL-1, 美国生命技术有限公司)培养，置37，
13、5CO 2恒温培养箱中，每隔 34d传代10。HUVEC-12以DMEM/F12培养基11 (含10胎牛血清、青霉素100 kUL-1、链霉素100 kUL-1、0.1 mgmL-1肝素和0.03 mgmL-1的内皮细胞生长添剂，美国生命技术有限公司)。取RAW 264.7、UMR-106或HUVEC-12细胞，用0.25胰蛋白酶消化，制成每毫升含5 x 103个细胞的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板(每孔 100L)，每组设3个平行孔。放置一夜后 , 加入阴性对照溶剂或供试样品溶液，共同培养24或48h后，于每孔加入5mgmL -1的噻唑蓝(MTT, 美国Sigma公司) 30L。继续培养
14、4 h后弃去上清，吸干残留液，每孔加入DMSO100L ，振摇至生成的蓝紫色甲瓒结晶完全溶解后，用酶标仪(美国伯乐公司) 测定540 nm处吸光值，计算细胞生长率。2.3 一氧化氮 (NO) 释放试验将每毫升含5 X 10 5个细胞的RAW264.7单细胞悬液接种于48孔培养板(每孔300L)，每组设3个平行孔。放置过夜后，加入阴性对照溶剂或供试样品溶液，培养2h后，加入LPS(终浓度1gmL -1, 经预实验结果表明,RAW264.7在1gmL -1的刺激下释5放NO的量明显升高，约2.7倍, p0.05)，置培养箱中培养24h后，吸取培养液上清100L至酶标板中，加入等体积的 Griess
15、试剂(美国 Sigma公司)。室温反应5 min后测定540nm处吸光值。用浓度为 0, 3.125 6.25, 12.5, 25, 50, 100molL-1的NaNO 2绘制标准曲线，根据标准曲线计算细胞培养上清液中NO的浓度以及供试品对NO释放的抑制率。2.4 UMR-106和HUVEC-12细胞增殖试验取UMR-106或HUVEC-12细胞，制成每毫升含5 x 10 3个细胞的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每组设3个平行孔。放置一夜后, 加入阴性对照溶剂或供试样品，共同培养24或48h后，于每孔中加入3H-TdR0.5Ci继续培养6h，用多孔细胞收集仪 (美国Packard公司)
16、 将细胞收集于玻璃纤维滤膜上，在液体闪烁示踪仪(美国 PerkinElmer公司)上测定。与阴性溶剂对照组相比，计算细胞增殖率。2.5 统计学分析数据均以Error! s表示，利用SPSS(13.0)对两組及两組以上的差异分別采用Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis H检定；实验数据进一步采用均匀设计软件(WUST 5.0，中国东北制药总厂)进行多元回归，建立生物效应与药物剂量之间的关系方程。所有检验的显著性界限水平定为0.05。3 结果与讨论3.1 复方提取物对RAW264.7细胞增殖和释放NO的影响复方提取物对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7释放炎症因子(NO)和细胞
17、生长的影响分别采用Griss颜色反应和MTT比色法测定。结果表明，五组复方中， 1、3和4号的水提物和醇提物分别在2000gmL -1和240gmL -1的高浓度下显示出47.6%57.6%的NO抑制作用；2号、5号的水提物和醇提物分别在1000-2000gmL-1和120-240gmL -1浓度范围内表现呈现剂量依赖性的NO抑制作用，抑制率为47.8%75.2%。MTT试验中, 五组复方的水提物和醇提物在 0-2000gmL-1和0-120gmL -1范围内对巨噬细胞的生长具有显著的增殖作用,表6明复方的NO抑制效应与细胞毒作用无关。但复方对RAW264.7的增殖强度在2000gmL-1和1
18、20gmL -1开始下降，1号和2号的醇提物在240gmL -1对细胞的生长已显示出抑制作用，见图1。NO是炎症和疼痛反应的重要介质，LPS激活巨噬细胞, 过度释放NO的反应已被广泛用于评价镇痛抗炎药的活性和机理12。本研究利用该模型测试复方抑制炎症，缓解疼痛的功效。结果表明，复方的水提物和醇提物均能抑制病理状态下NO的合成，两种提取物中都含有相关的有效成分。证明了复方潜在的抑制炎症，缓解疼痛等骨折并发症的功效。在所测试的5组配方中，以2号和5号的抑制效果更佳。0204060801001201401601802002200 0.0625 0.125 0.25 0.5 1 2一氧化氮抑制率(%)
19、020406080100120140160180200MTT-细胞增殖率(%)F1-NO F2-NO F3-NO F4-NO F5-NOF1-MTT F2-MTT F3-MTT F4-MTT F5-MTT* * * * 细胞增殖率()A. 0 00200 #608010012014016018020022062. 0 500 000 000一氧化氮抑制率()02040608010120140160180200MTT-细胞增殖率(%)F1-NO F2-NO F3-NO F4-NO F5-NOF1-MTT F2-MTT F3-MTT F4-MTT F5-MTT/gmL-1#020406080100
20、1201401601802000 15.6 31.2 62.5 125 250一氧化氮抑制率（）020406080100120140160180MTT-细胞存活率（）F1-NO F2-NO F3-NO F4-NO F5-NOF1-MTT F2-MTT F3-MTT F4-MTT F5-MTTB/gmL-1 * * *# # # # # #010020030400500600708000 15 30 60 120 240020406080100120140160180图1: 复方提取物对巨噬细胞(RAW264.7) 释放一氧化氮 (NO) 和细胞生长的影响。被1gmL -1LPS激活的RAW26
21、4.7细胞与阴性溶剂或供试品溶液共同培养24小7时后，测试细胞存活率和NO抑制率。A：复方水提物(0-1mgmL -1)；B：复方醇提物(0-0.12mgmL -1)。各数值代表五次实验的平均值标准偏差。*代表与阴性对照相比，有显著性差异。 3.2 复方提取物对成骨细胞增殖的影响复方提取物对大鼠成骨细胞UMR-106生长的影响采用3H-Thymidine (3H-TdR) 渗入法和MTT比色法同时测定。3H-TdR实验结果表明，五组复方的水提物和醇提物对成骨细胞分别表现出110%-497%和111%-140%的增殖作用。水提物在15.6-2000gmL-1，醇提物在30-240gmL -1范围
22、内的增殖效果均有显著性意义。增殖效应呈明显的剂量依赖性。MTT试验中，复方提取物亦表现出类似的效果，五组复方的水提物和醇提物分别在62.5-500gmL -1和30-120gmL -1范围内表现出124%-146%和123%-160%的增殖效果。两种不同灵敏度的试验共同证明了复方对成骨细胞显著的增殖作用，见图2。UMR-106是大鼠骨肉瘤细胞系，具有成骨细胞的多种特性。成骨細胞是骨形成過程中的重要功能細胞，UMR-106细胞的生物学行为因此成为研究骨科用药的常用模型13。本研究选择该模型证明了复方对成骨细胞生长的强烈的促进作用。这与复方中所含接骨续筋药的传统功效相吻合。另一方面，复方中所含活血
23、化瘀药促进血液循环，加强骨折局部新陈代谢，为骨折端提供丰富的营养物质，也可能是促进骨细胞新生的重要原因。关于活血化瘀和新骨再生的内在联系的深入的研究有利于更清晰的揭示中医复方促进骨折愈合的机理。801002003004005006007008000 7.8 15.6 31.2 62.5 125 250 500 1000 20000204060801001201401603H-TdR-细胞增殖率(%) AMT-细胞增殖率(%)#0204060801001201401601802000 0.125 0.25 0.5 1020406080100120F1-MTT F2-MTT F3-MTTF4-MT
24、T F5-MTTF1-3H F2-3H F3-3H F4-3HF5-3H /gmL-1* * * * * * * * * * * * * * * *#* * # 01002003004005006007008000 15 30 60 120 240020406080100120140160180#3H-TdR-细胞增殖率(%) BMT-细胞增殖率(%)0204060801001201401601802002202400 0.15 0.3 0.06 0.12020406080100120140160F1-MTT F2-MTT F3-MTT F4-MTT F5-MTTF1-3H F2-3H F3-
25、3H F4-3H F5-3H/gmL-1* * * * * *#* *#* * * * * * * * * *图2: 复方提取物对成骨细胞(UMR-106)增殖的影响。UMR-106与阴性溶剂或供试品溶液共同培养24小时后，采用3H-TdR渗入法和MTT比色法测定细胞增殖率。A：复方水提物(0-1mgmL -1)；B：复方醇提物(0-0.12mgmL -1)。各数值代表五次实验的平均值标准偏差。*代表在3H-TdR试验中，与阴性对照相比,有显著性差异。#代表在MTT试验中，与阴性对照相比, 有显著差异。3.3 复方提取物对人体静脉上皮细胞增殖的影响复方提取物对HUVEC细胞增殖的影响通过3H-
26、TdR渗入法和MTT比色法同时测定。3H-TdR渗入法实验中，3号和5号复方的水提物在500-1000gmL -1范围内对HUVEC的增长显示出125-144%的促进作用；而五组复方的醇提物在62.5-9125gmL-1以及4号和5号复方醇提物在250gmL -1显示出120%-164%的增殖作用；五组复方的醇提物在500gmL -1则显示出明显的抑制HUVEC生长的作用。MTT实验中，只有500gmL -1显示出细胞毒作用，其它浓度下的复方提取物对HUVEC的生长未产生显著影响。这可能与MTT试验的灵敏度相对偏低有关。血管生成是骨折愈合的重要环节，良好的血液循环是血管生成的前提条件。活血化瘀
27、中药及其有效成分对血管生成的影响已逐渐被关注，三七及其有效成分Rg 1被发现对血管生成能产生一系列促进作用14。本研究测试复方对血管生成体外HUVEC模型的影响发现，五组复方的提取物均能显著促进HUVEC细胞的增殖，预示了其对血管生成的促进作用。也提示活学化瘀中药对血管生成的影响及其相关的临床治疗意义有待于深入研究。0204060801001201401601802000 0.125 0.25 0.5 1020406080100120F1-MTT F2-MTT F3-MTTF4-MTT F5-MTTF1-3H F2-3H F3-3H F4-3HF5-3H3H-TdR-细胞增殖率(%) AMT-
28、细胞增殖率(%)0204060801001201401601802000 125 250 500 1000020406080100120* */gmL-1100501001502002503000 62.5 125 250 5000204060801001203H-TdR-细胞增殖率(%) BMT-细胞增殖率(%)0204060801001201401601802002202400 0.1 0.3 0.06 0.12020406080100120140160F1-MTT F2-MTT F3-MTT F4-MTT F5-MTT*#F1-3H F2-3H F3-3H F4-3H F5-3H/mgm
29、L-13H-TdR-细胞增殖率(%) BT-细胞增殖率(%)*0204060801 01201401601802000 015 03一氧化氮抑制率（）406080100124160180细胞存活率 （）F1-NO F2-NO F3-NO F4-NO F5-NOF1-MTT F2-MTT F3-MTT F4-MTT F5-MTT/-1* * * * * * * * * * * *图 3: 复方提取物对人体静脉上皮细胞 (HUVE-12)增殖的影响。HUVEC 与阴性溶剂或供试品溶液共同培养 48 小时后，采用 3H-TdR 渗入法和 MTT 比色法测定细胞增殖率。A：复方水提物(0-1mgmL
30、-1)；B： 复方醇提物(0-0.12mgmL -1)。各数值代表五次实验的平均值标准偏差。*0.05 代表在 3H-TdR 试验中，与空白对照组相比，细胞增殖率有显著意义。#0.05 代表在 MTT 试验中，与空白对照组相比，细胞增殖率有统计意义。中药复方是中医用药的特色和精髓，复方的机理研究是中医药现代化的难点之一。选择现代生物学中快速，方便的细胞模型进行复方的体外研究是筛选和评价复方药效的有利工具。本课题根据中医治疗骨折的用药原则，选择炎症因子释放，人体静脉上皮细胞和成骨细胞的增生来反映中医抗炎镇痛，促进血液循环和新骨的再生的传统功效。结果证明，在所选的三项生物试验中，复方的水提物和醇提物均显示出显著的活性，说明复方两种提取物中均含有相关的有效成分。所选的细胞株及测试指标对中药及复方的相关功能具有针对性和代表性。另一方面，试验结果也说明，复方的剂量和配比对生物效应均存在着显著的影响，在低浓度剂量范围内，少数复方能够产生显著活性，复方之间的差异较明显；而高浓度时，复方的生物活性类似，差异较小。综合三项测试结果，五组复方配比中，只有 5 号方同时具备剂量依赖性的抑制 NO 释放，促进 HUVEC 和UMR-106 细胞增殖的功效，为较优组合。
