1、撒立安灭菌、消毒原理及效果,一、消毒原理,1967年，日本东京大学的本多建一教授和博士班学生藤岛昭发现，用光照射二氧化钛电极可进行水的电解反应。这就是著名的“本多作用光反应，将空气中的水或氧气催化成氧化能力极强的羟基自由基（-OH）和超氧阴离子自由基（O2）、活性氧（H O2 ，H2O2）等具有极强氧化能力的光活性基团，这些光活性基团的能量相当于3600K（3300多）的高温，具有很强的氧化性，,一、消毒原理,这些强氧化性基团可强效分解各种具有不稳定化学键的有机化合物和部分无机物，并可破坏细菌的细胞膜和凝固病毒的蛋白质载体。在复杂的细菌细胞体系内, 由光反应作用所引起的致死性的氧化反应一旦发生
2、, 反应对细胞的损伤作用在闭光条件下也会通Fenton反应或自由基对脂类的过氧化连锁反应而得到延续。 其中, 大肠杆菌E. coli 对光反应作用表现出更高的敏感性。 这与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 的细胞结构, 特别是细胞壁的成和厚度有很大关系。 相比而言, 在单一的紫外光作用下, 抗菌效果并不明显。 这是因为紫外光对细菌细胞的损伤并非持久性的,纳米二氧化钛在光照射下，价带电子被激发到导带，形成了电子和空穴，与吸附于其表面的O2和H2O作用，生成超氧化物阴离子自由基O2-和羟基自由基-OH，其自由基具有很强的氧化分解能力，能破坏有机物中的C-C键、C-H键、C-N键、C-O键、O-H键、N-
3、H键，分解有机物为二氧化碳与水；同时破坏细菌的细胞膜固化病毒的蛋白质，从而杀死细菌、病毒。,二、氧化离子的形成,三、产生杀菌消毒需具备的条件,氧气及水分子纳米二氧化钛表面；光照射强吸附,四、杀菌、消毒效果实验（二）,一、实验步骤 所需仪器及物品： 振荡器、培养箱、PCR仪、离心机 干粉灭菌剂撒立安-稀土20nmTiO2蒙脱石、普通TiO2蒙脱石、某进口干粉灭菌剂、标准菌株、 2.1菌株培养将菌落、沙门和金黄色葡萄球菌分别接种于相应培养基,置于旋转摇床37培养,摇床转速110r/min。当细菌生长处于对数期或稳定生长期时,取培养的悬菌液10mL于灭菌离心管内以5000r/min离心5min,再以
4、无菌蒸馏水(调节pH值为7.2)水洗离心两次,最后稀释成一定初始浓度的悬菌液备用。细菌初始浓度以显微计数法测得。,四、杀菌、消毒效果实验（二）,2.2灭菌试验。 取初始浓度为N0=1.0105cfu/ml的悬菌液、N01=2.1105cfu/ml沙门氏菌、N02=2.1105cfu/ml金黄色葡萄球菌的悬菌液各1mL于培养皿中。做1个对照，其它按照5g/m2的量均匀撒入干粉剂5g/m2，普通光下和紫外光下分别作用2小时后，注入5ml生理盐水，混匀，取此悬菌液做3个稀释度，注入营养琼脂，移入37培养箱中培养。 2.2.1灭菌性能评价 1）不同光照下的灭菌效果灭菌性能以细菌杀灭率X=(N0-Nt)
5、/N0(初始细菌浓度N0-细菌存活率为残余细菌浓度Nt之差与初始细菌浓度N0之比)来评价。平板菌落计数法测定。,四、杀菌、消毒效果实验（对比试验）,表1.1紫外光照射下对致病菌杀灭效果,撒立安-稀土20nmTiO2蒙脱石、普通TiO2蒙脱石、某进口干粉灭菌剂,四、杀菌、消毒效果实验（对比试验）,表1.2紫外光照射下对细菌杀灭效果,撒立安-稀土20nmTiO2蒙脱石、普通TiO2蒙脱石、某进口干粉灭菌剂,四、杀菌、消毒效果实验（对比试验）,表1.3普通可见光照射下对细菌杀灭效果,撒立安-稀土20nmTiO2蒙脱石、普通TiO2蒙脱石、某进口干粉灭菌剂,四、杀菌、消毒效果实验（对比试验）,表1.4
6、普通可见光照射下对致病细菌杀灭效果,撒立安-稀土20nmTiO2蒙脱石、普通TiO2蒙脱石、某进口干粉灭菌剂,四、杀菌、消毒效果对比实验结论,紫外线波长在240280nm范围内最具杀破坏细菌病毒中的DNA（脱氧核糖核酸）或RNA（核糖核酸）的分子结构，造成生长性细胞死亡和（或）再生性细胞死亡，达到杀菌消毒的效果。但在紫外光作用下, 抗菌效果并不明显。 这是因为紫外光对细菌细胞的损伤并非持久性的, 这些受损的细胞在酶的作用下能通过可见光复活或暗修复而得到修复。,四、杀菌、消毒效果对比实验结论,2、负载TiO2蒙脱石在可见光的照射下会产生出氧化能力极强的自由氢氧基和活性氧，这些产物可破坏细菌的细胞
7、膜和凝固病毒的蛋白质从而杀灭细菌病毒。但普通TiO2蒙脱石，由于TiO2为非纳米粒径，故在紫外光照射下有良好的90%杀菌率；而只有稀土纳米TiO2蒙脱石有稀土掺杂螯合的纳米结构的二氧化钛，分布在具有强大的比表面积的蒙脱石表面，吸附空气中水分，在可见光作用下，不仅吸收紫外光能量对红外等光能也能吸收而产生氧化能力极强的自由氢氧基和活性氧，呈现出很好的99%杀菌效果，对致病菌也有较好的杀灭作用。,四、杀菌、消毒效果实验之验证,撒立安杀菌效果不仅从杀菌率来得以验证。从杀菌后的菌液PH值变化也能看出。灭菌后的生理盐水PH值降低2个值，由4变为2。 菌液 pH 值的下降归因于两方面: 一方面,TiO 2
8、水悬浮液受光激发产生 OH- 的同时会离解出大量的 H + ; 另一方面, 细菌细胞内含物及其壁外有机组分在活性氧类的作用下会被分解成小分子量的脂肪酸类。,四、杀菌、消毒效果独立实验,一，灭菌剂的最佳使用量 取5份初始浓度为N0=1.0105cfu/ml的悬菌液各1mL于培养皿中，分别按照0g/ 1g/m23g/m2 5g/7g/的量撒入干粉剂，在普通光下作用2小时后，注入5ml生理盐水，混匀，取此悬菌液做3个稀释度，注入营养琼脂，移入37培养箱中培养。五次重复此实验，取结果取平均值。,四、杀菌、消毒独立实验效果,可见,随灭菌剂用量增加,灭菌率增大,但递增趋势逐渐减弱,当灭菌剂用量达到5g/m
9、2时,增势已不明显;当灭菌剂用量过低时,光激发产生的光量子不能被有效利用,有效光子不能完全转化为化学能,光致活性氧减少,从而灭菌率较低;但灭菌剂用量过多,溶液浑浊度增加,光散射对溶液透光率的影响效应逐步占据主导作用,光强在溶液中衰减,量子效率降低,导致灭菌率反而下降。,四、杀菌、消毒独立实验效果,二，多次使用灭菌剂细菌是否产生耐受性 用金黄色葡萄球菌标准菌株，制得第一代菌悬液，使用撒立安灭菌剂灭菌实验方法同2.2，再取未杀死的典型金黄色葡萄球菌培养做为第二代，撒立安灭菌剂灭菌实验，转接至第五代，观察灭菌率情况。如下表,四、杀菌、消毒独立实验效果,结论：细菌的生理状态和细菌的变异作用也是影响细菌
10、对光催化作用敏感性的重要生物学因素。实验中,分别对第1代细菌细胞(新接种)和第5代细胞(经过灭菌剂处理,接种培养再处理,反复4次)进行对比实验,灭菌剂用量为5g/,可以看出,经多次灭菌剂处理后的两种细菌细胞均比刚接种时对光作用并未表现对灭菌剂产生耐受性。一方面由于前期照射中产生的受损细胞未完全得到修复,对ROS氧化作用抵抗力降低;另一方面,细胞对损伤DNA的修复会导致基因的突变,这些突变使得细菌对光作用表现为非耐受性,五、对禽流感病毒的杀灭作用,将含有禽流感、新城疫病毒的病料制成悬浊液液，铺满平皿，加入灭菌剂，作用4小时，加入生理盐水，离心分离，将收集的上清液全部进行核酸提取，上机，PCR扩增测试。,五、对禽流感病毒的杀灭作用,五、对禽流感病毒的杀灭作用(1),五、对禽流感病毒的杀灭作用(2),结论,普通二氧化钛改性蒙脱石在可见光下对细菌的杀灭作用效果不好。稀土-纳米二氧化钛改性蒙脱石依靠蒙脱石强大的比表面积吸附空气中水分，在可见光作用下，在纳米二氧化钛表面分解出氧化能力极强的自由氢氧基和活性氧，这些产物可破坏细菌的细胞膜和凝固病毒的蛋白质从而杀灭细菌病毒。吸附水分，干燥环境，去除氨气，是一种环境友好的杀菌消毒剂。,
