1、流 式 细 胞 术,徐琦 副教授新疆医科大学 基础医学院免疫学教研室,第一节 流式细胞术概述,流式细胞术,流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选,流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。,细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量,流式细胞术的特点,流式细胞仪,流式细胞仪 是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞
2、的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。,BD LSR,通过流式细胞仪我们可以得到以下信息 - 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度,流式细胞仪常检测的细胞特性,基础研究,淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究,临床研究,淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型
3、、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度,第二节流式细胞仪工作原理,采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。,一、工作原理,基本工作原理,基本过程,流式细胞仪与显微镜的区别,现代流式细胞仪包括,液流系统 聚焦细胞以供检测光学系统 激发和收集光信号 电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析细胞分
4、选系统,由样本和鞘液组成待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。,1. 液流系统,液流系统,液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处,液流系统示意图,FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）,样本管,鞘液管,激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL
5、3, FL4（荧光）,2. 光学系统,光学系统示意图,（1）激光光源,单波长、高强度、高稳定性多采用氩离子激光器或氦氖激光器一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光最多检测13个荧光参数,Optical Filters,460 500 540,460 500 540,460 500 540,SP 500,LP 500,BP500/50,LongpassShortpassBandpass,光收集系统：光电倍增管（PMT）,流式细胞仪的光信号,散射光信号荧光信号,(2) 散射光信号,前向角散射光（FSC,Forward Scatter）入射激光的同向散射光信号
6、细胞相对大小及其表面积。 侧向角散射（SSC, Side Scatter）入射激光90角的散射光信号细胞粒度及细胞内相对复杂性。,前向角散射光 FSC,Forward Angle Light Scatter,侧向角散射光SSC,Side Scatter,散射光,散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 -通常使用“散点图”来看散射光信号 -散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据,散点图Dot Plot,lysed whole blood,测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表
7、面分子。,淋巴细胞,单核细胞,中性粒细胞,光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群,荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。线性放大器和对数放大器,（3）荧光测量,荧光信号,荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能释放较入射光波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强,双色荧光散点图,荧光检测器,荧光补
8、偿,光谱交叉,两色以上荧光分析存在 光谱交叉,荧光补偿方法,所有补偿调为“0”调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角”依单阳群体调节荧光补偿,调与未调补偿,FL1,FL2,注意！,用来调节补偿的FITC、PE抗体必须有明显的阳性信号，否则就不会出现荧光渗漏现像，调节补偿也无从入手。在正式数据采集前要调整好补偿，一旦数据被获取，BD、Coulter仪器无法再改变补偿partec流式细胞仪提供软件调节补偿技术，无论何时都可重新调节多色荧光补偿调节方法同双色法,主要由计算机及其软件组成,3. 电子系统,4. 细胞分选系统,第三节流式细胞术数据显示,单参数直方图双参数直方图:点图 二维等
9、高图 假三维等高图三参数直方图多参数分析,直分析方图,设门分析:REGION和GATE设置,数据显示方式,FS：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少,参 数,由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（一）单参数直方图,单参数直方图,X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率,双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常
10、采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（二）双参数直方图,双参数直方图点图,便于数据统计不同的细胞群可以用不同的颜色标记主要表达方式,2. 二维等高图,由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。,二维等高图,假三维等高图,三参数直方图,多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。,（四）流式细胞仪的多参数
11、分析,数据分析,设门设定阴性与阳性群体的界限确定阳性与阴性细胞群体统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数,Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。,根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。,三、设门分析技术,A 淋巴细胞B 单核细胞C 中性粒细胞,A、B、C均为任意门,线性门,Region设置: 区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。,D1 CD4+/CD
12、3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+,如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。,第四节流式细胞样品制备,标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他实验的不同，选用不同的抗凝剂。,EDTA： 2mg/ml枸椽酸钠：0.38%肝素：15IU/ml,可选的抗凝剂有：,标本处理时间：,新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析,样本固定方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。,样本处理标准试剂：,一、10%Bovine Serum Albumin BSA,1. 溶解10
13、g BSA至100ml蒸馏水中,2. 4C，20000 g离心30分钟,3. 分装后-20C保存,二、0.1% BSA-PBS缓冲液,1. 准备500ml，PH7.3 PBS,2. 加入5ml 10% BSA,3. 使用0.45um滤网过滤,三、氯化铵溶血剂,1. 在一升蒸馏水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA,2. 调节PH值至7.2,3. 在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤,方法一：溶血法,取100 ul抗凝全血；,2. 快速加入 2ml NH4CL溶血剂,混匀；,3. 室温孵育5分钟；,4. 4C，400g离心10分钟。去上清，加入2ml
14、 BSA-PBS；,5. 4C，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS；,6. 4C，400g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。,收集白细胞,方法二：密度离心法提取单个核细胞,Histopaque 1077为Ficoll与Sodium diatrizoate(泛影酸钠)混合物，其密度为1.1191.077。通过离心可将全血中的粒细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.1191.077的血浆层，而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。,1. 准备2ml抗凝血（根据实验要求确定用血量）， 等量PBS稀释；,2. 准备1ml Histopaque 1077 (S
15、igma)；,3. 室温下700g离心30分钟；,4. 仔细将含有单个核细胞血浆层吸出；,5. 加4ml BSA-PBS，400g离心10分钟；,6. 加2ml BSA-PBS清洗2次。,操 作,淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤便可。,从组织获取淋巴细胞,将样本置于陪替氏培养皿，加入15ml BSA-PBS；将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离；将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。,方 法：,其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。,单细胞悬液的保存深低温保存法（一
16、年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）,抗体染色一般方法,外周血白细胞分析：100ul全血血小板分析：15ul全血（根据样本血小板数量）红细胞分析：1ul全血（根据样本中红细胞数稀释后使用）骨髓：100ul其他样本，计数后决定使用体积,目标细胞数量及检测终浓度：1106/ml,细胞计数方法,传统手工计数：耗时、准确度差流式细胞仪计数：BD，Coulter仪器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？partec仪器:最为精密的细胞计数器，直接报告细胞浓度,反应体积,样本中加完抗体后， 1106细胞反应体积应 不小于100ul。,上机检测,样本染色及溶血过程处理完后
17、应立即上机检测打开流式细胞仪：预热及进行质控程序选择相应的方案或新建方案加载或重新调节各参数上样检测,第五节流式细胞荧光标记,选择合适的荧光染料,必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内荧光素光谱的重叠应当尽量减少,抗体使用原则,根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE、APC使用双标以上抗体必做荧光补偿,激光,细胞悬液,异硫氰酸荧光素,得州红,能量传递复合染料,藻胆蛋白类,几种常见的荧光染料,常用的几类荧光染料,用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染
18、料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。,能量传递复合染料,488nm,575nm,670nm红色荧光,花青苷5,藻红蛋白,能量传递复合染料机制,荧光染料与细胞成分的四种结合方式结构亲和式嵌入结合共价键结合荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记方法直标:干扰少,但需购买多种单抗间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体组合标记,（二）免疫荧光标记,免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测
19、速度极快，所以又有“液相芯片”之称 。,三、免疫胶乳颗粒技术的应用,微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）,通过对标记不同荧光素分子的检测，实现FCM对可溶性物质的定量分析,第六节流式细胞术质量控制,适当的制备方式处理红细胞实体组织来源标本用机械法温度2537，pH7.07.2,（一）单细胞悬液制备的质控,温度pH染料浓度固定剂,（二）免疫荧光染色的质控,光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准:
20、保证计数的准确性。,Flow-check,Flow-set,Flow-count,（三）仪器操作的质控,同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。,（四）免疫检测的质控,关于同型对照,例：一个双色染色的实验 抗体A FITC，抗体B PE 对应的同型对照是IgG1 FITC,IgG1 PE那么需要准备的是阴性对照：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE单阳性对照： FITC: 细胞加上Ab A FITC, IgG1 PE PE: 细胞加上Ab B PE, Ig
21、G1 FITC,第七节凋亡细胞的检测,Apoptotic Cell Death - a genetically encoded cell death program, which is morphologically, biochemically and molecularly distinct from necrosis,Flow cytometry of apoptotic cell death,细胞散射光 在细胞调亡中，细胞收缩，从而FSC下降，SSC上升或是没有明显变化,Flow cytometry of apoptotic cell death,荧光吸收细胞的胞膜对于DNA染料的通透
22、性和细胞的活性、死亡和凋亡相关，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用来区分活细胞、死细胞和凋亡细胞,Flow cytometry of apoptotic cell death,FCM of Caspases通过抗体和活化的caspase-3片断相结合来检测 使用特异性的caspase-3荧光底物新的抗原决定基CK18,Flow cytometry of apoptotic cell death,线粒体功能的变化 TMP会在调亡中产生，可以通过一些标记用流式细胞仪检测。使用有膜穿透性的亲脂性阳离子荧光染料，如Rh123, DiOC6, JC-1,CMXRos等，可作为流式检测的探
23、针。 当细胞发生调亡时，一个线粒体膜表面蛋白7A6抗原会出现Bcl-2/bax family of proteins.,Flow cytometry of apoptotic cell death,钙离子流和 pH值变化 胞浆内Ca2+ 水平的上升和由于细胞内环境酸化造成的选择性的pH值的调节降低是伴随着细胞凋亡产生的后果之一。使用Ca2+ 选择性荧光探针，如 Quin-2, Fluo-3, Indo-1 通过流式检测是测定细胞内Ca2+浓度的最佳方案酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等进行检测,Flow cy
24、tometry of apoptotic cell death Phospholipid redistribution,Flow cytometry of apoptotic cell death,DNA 链的断裂细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。 断裂的末端可以通过末端转脱氧核苷酰酶(TdT)连接上dUTP。,Flow cytometry of apoptotic cell death,细胞DNA含量 在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这
25、是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细胞内DNA含量下降造成的。,Flow Cytometry of Apoptotic Cells,第八节流式细胞术在不同领域的应用,流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。,一、 在免疫学检验中的应用,T淋巴细胞及其亚群分析Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴细胞及其亚群分析B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫
26、病的发生有关B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体NK细胞分析NK(CD3-CD16+CD56+),1. 淋巴细胞及其亚群的分析,细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例)细胞内细胞因子测定,2. 淋巴细胞功能分析,3. 淋巴造血系统及白血病免疫分型,对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变,CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例,MDR(+)表示对化疗药物耐药,4. 肿瘤耐药基因分析,5. AIDS病检测中的应用,二、流式细胞仪的临床应用,HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细
27、胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA-B27检查血小板功能及相关疾病,结束语,流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，我们的宗旨是将这项高新技术灵活运用于临床、科研等领域，报告最科学、最真实的客观数据，以服务于全社会。,小 结,流式细胞术（FCM）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现对单个细胞进行定量分析或纯化分选。FCM分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向散射光反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光反映颗粒被染上荧光部分数量
28、的多少，根据其标记的抗原分子不同，即反映了不同抗原分子的表达情况。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。对各项工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，是保证FCM分析中各项检测数据和指标可靠性的关键。,思考题,流式细胞仪的分析检测原理是什么？流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。何谓荧光补偿？FCM分析中有哪些数据显示方式，如何解读结果及其设门分析的意义？如何进行FCM分析检测样品的制备？流式细胞分析前如何验证仪器工作状态，采用何种校正物？流式细胞免疫分析的质量控制包括哪些方面？流式细胞仪分析中常见的荧光素有那些？他们的特性如何？,某研究生想检测临床抗癌新药A对于宫颈癌细胞的作用？请您提供一些思路及实验方案。,讨 论,
