1、本科毕业论文（20 届）大血藤的病虫害鉴定与及防治所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I目录目录 .I摘要 .II关键词 .IIAbstract .IIKeywords. II0 引言.11 材料与方法.11.1 试验时间、地点.11.2 实验材料.11.2.1 标本采集.11.2.2 生物防菌.11.2.3 试剂.11.2.4 仪器设备.11.2.5 PSA 培养基的制备 .11.3 试验方法.11.3.1 病症的观察与描述.11.3.2 病原菌的分离与培养.11.3.3 病原菌的鉴定.21.3.4 生物防菌对病原菌的抑制的测定.22 结果与分析.
2、22.1 病症的观察与描述.22.2 分离培养结果.22.3 显微镜镜检结果.32.4 生防菌预防结果与分析.33 结论与讨论.4参考文献.6致谢.7II大血藤的病虫害鉴定及防治摘要：为了了解和鉴定出引起大血藤病害的微生物，通过组织分离法从叶片中分离得到病原菌，并对病原菌进行培养和鉴定。显微镜检的病原菌特征表明，引起大血藤病害的是丝核菌（Rhizoctonia)和链格孢属（Alternaria Nees)。引起玉泉的大血藤病害的这两种病原菌，可以通过生物防治来减少病害的危害。关键词：大血藤；病虫害；丝核菌；链格孢属；生物防治 Damage identification and control
3、of the primary diseaseAbstract: in order to understand and identify the bacteria that cause Sargentgloryvine disease, pathogenic bacteria isolated from the leaves obtained by tissue isolation method, and culture and identification of pathogenic bacteria. Showed that the pathogen characteristics of m
4、icroscopy, primary disease is caused by Rhizoctonia (Rhizoctonia) and Alternaria (Alternaria Nees). The two pathogens Sargentgloryvine Stem disease in Yuquan, can reduce damage by biological controlKeywords: Caulis Sargentoxae; pests and diseases; Rhizoctonia; Alternaria spp.; biological control10 引
5、言 大血藤(Caulis Sargentodoxae） 又名血藤、红皮藤、千年健等，为木通科植物大血藤的茎，生于山坡疏林、溪边；有栽培。主产湖北、四川、江西、河南、江苏、安徽、浙江、云南、贵州等地。落 叶 木 质 藤 本 ， 长 达 到 10 余 米 。 藤 径 粗 达 9 厘 米 ， 全 株无 毛 。当 年 枝 条 暗 红 色 ， 老 树 皮 有 时 纵 裂 。大血藤茎含大黄素、大黄素甲醚、 -谷 甾 醇 、 硬 脂 等 多 种 化 学 成 分 。 其 茎 可 以 入 药 ， 具有败毒消痈、活血通络、祛风杀虫的作用。治急慢性阑尾炎、风湿痹痛、赤痢、血淋、月经不调、疳积、虫痛、跌扑损伤等。其花
6、为总 状 花 序 ， 长 6-12 厘 米 ， 花 为 紫 色 ， 花 期 4-5 月 ， 果 实 的 颜 色 由绿 色 到 蓝 紫 色 ， 成 熟 为 红 色 ， 果 期 6-9 月 ， 花 和 果 都 具 有 很 高 的 观 赏 价 值 。 所 以 ，大 血 藤 由 于 具 有 很 高 的 经 济 价 值 而 被 广 泛 的 种 植 。但 近 几 年 来 ， 大 血 藤 却 遭 受 很 多 种 病 害 ， 严 重 的 影 响 了 它 的 生 长 发 育 ， 降 低 了它 的 药 用 价 值 和 观 赏 价 值 ， 引 起 了 政 府 、 广 大 农 民 、 专 家 、 学 者 的 重 视
7、。 引起大血藤病害的原因多种多样，如今经过前者研究得之的有：大血藤黄化病；大血藤炭疽病；蜂、 、袋蛾类、红蜡蚧、螨类、刺蛾类等引起的病害。本 文 对 大 血 藤 进 行 初 步 的病 害 分 析 ， 简 要 提 出 对 大 血 藤 几 种 病 的 防 治 措 施 ， 以 期 为 贵 州 省 黔 东 南 州 大 血 藤 病害 的 研 究 有 一 定 的 参 考 价 值 。而本文从生防菌防治的角度提供了新的视野，采用组织分离法分离得到大血藤丝核菌、链格孢属病原菌，通过对病原菌的培养性状、分生孢子的形态观察，证明了引起大血藤为丝核菌、链格孢属病原菌。本实验用 F19、F18、F2 三种生物防菌对丝核
8、菌、链格孢属具有高效的抑制作用，特别是 F19 和 F2 两种生防菌。这实验说明了除了传统的化学试剂、农药灭菌，我们还可以产用新的方法生物防菌。它避免了传统的农药灭菌引起病原菌的抗药性增强，造成药物的浪费，灭菌效果低以及药物沿着食物链和食物网集留在更高的营养极，给生物体带来危害的情况。并且它用量低，专一性强。从生态系统的平衡和经济的角度来说，它更科学，更实用。1 材料与方法1.1 试验时间、地点生物实验室和显微镜实验室进行。1.2 实验材料1.2.1 标本采集 分别对玉泉和银屏县边沙村两地大血藤进行病害标本的调查和采集，并对整植株危害程度进行记录，采集新鲜标本用于室内分离鉴定。1.2.2 生物
9、防菌 从北京微生物研究所购得，有 F19、F18、F2 等1.2.3 试剂 无水乙醇、70的酒精、工室外试验于 2012 年 1 月分别在玉泉进行，室内试验在凯里学院环境与生命科学学院微业酒精、升汞、链霉素。1.2.4 仪器设备 电热恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、无菌操作台、显微镜等1.2.5 PSA培养基的制备 取1000克干净水倒入电饭锅中，再将称好的200克的马玲署块、17克的蔗糖放进水里，加热，用玻璃棒不断搅拌，至马铃薯肉汁几乎溶解于水，停止加热，过滤，将17-18克的琼脂倒进滤液中，充分搅拌，待其冷却到50度左右，装入多个培养瓶中，封装，再放入高压蒸汽灭菌锅里进行121度的长达30分钟
10、的高压灭菌。1.3 试验方法1.3.1 症状的观察和描述 到玉泉和锦屏县边沙两地对大血藤的病害症状和发病程度进行观察，主要从病组织的表面病斑形态、颜色、大小及危害程度等方面进行观察和描述，并对危害组织进行拍照。1.3.2 病原菌的分离和培养 对于病原菌的真菌分离采用组织表面分离法。取病健交2界处的叶片小块组织 2-4mm，先用 70%的酒精对大血藤叶片病斑部进行表面消毒处理，然后放入 0.1%的升汞溶液中进行消毒 2 分钟，再放进无菌水中漂洗 3 次，移入 PSA 平板内培养。在 PSA 培养基上 28培养 34 天，病组织的周围长出不同的菌丝体，挑取外围新长的菌丝，分别移置到新的添加链霉素的
11、 PSA 培养基上，依次重复多次，直至得到纯的病原菌进行纯培养，然后对菌落进行观察、描述和拍照。1.3.3 病原菌的鉴定 对培养的真菌进行显微观察、描述以及照相。主要观察孢子的形态结构、颜色、菌丝的颜色是否有隔和分支。操作步骤：用灭菌后的接种针挑取少许菌丝，放在加有1 滴浮载剂（水）的载玻片上，盖上盖玻片后放在光学显微镜下观察、描述。同时对在显微镜下的病原菌进行拍照，以及对孢子大小进行测量、记录。1.3.4 生物防菌对病原菌的抑制的测定 通过观察F19、F18、F2三种生防菌从三个空间方向对病原菌的长势的影响，可以比较出哪种生防菌的抑制作用更强。2 结果与分析通过实验采用组织表面分离法分离和培
12、养得到病菌，经显微镜检查的结果，通过症状观察以及危害程度进行分析，最后鉴定为引起玉泉大血藤病害的的病原微生物是丝核菌和链格孢属。2.1 病症的观察描述图1 大血藤丝核菌病害病叶 图2 大血藤病害病叶左图叶片病斑为黄色、黑色、褐色的圆点、圆形或不规则的图形，成孤立的块状或网状沿着叶缘布满整片叶片。病斑大小约为1-20mm，病害的部位变得枯萎、腐烂，甚至空洞（见图1）。右图叶片病斑为黄色或黑褐色，近似圆或椭圆形，大小约为2-10，呈块状和圆形状孤立分布在叶尖和叶中，病害使叶尖枯萎j继而腐烂，病斑中心变得空洞(见图2）。2.2 分离培养结果3图3 丝核菌的菌落正面观 图4 丝核菌的菌落背面观丝核菌在
13、PSA培养基上培养时，菌落很大，呈棉花状生长。菌落中心向上突起，边缘整齐光滑，质地均匀柔润，不透明。菌落初期为白色，三天之后变苍白色，逐渐变为微黄色。培养基的背面观，呈鲜红色，中心呈红褐色，菌落具有明显的同心轮纹，由外到内轮纹颜色由浅到深。再培养到后期，培养基的背面观呈黑褐色（如图3，4）。图5 链格孢属的菌落的背面观 图6 链格孢属的菌落正面观链格孢属在PSA培养基上培养时，菌落较大，呈绒毛状生长，形成不规则“四叶草”型，菌落边缘粗糙，不光滑，质地不均匀不透明，不易挑取。中央长势较周围快。其培养基背面观呈灰黑色，中央部较周围颜色深（如图5，6）。2.3 显微镜镜检结果丝核菌 rhizocto
14、nia 属半知菌亚门,无孢目,丝核菌属。菌丝褐色,蛛网状,多直角分枝,近分枝处形成隔膜,缢缩状。病菌菌丝粗壮，初时无色，老熟时淡褐色，老熟菌丝常呈一连串桶形细胞，并可交织而成质地疏松的黑褐色菌核。 主枝细胞念珠状，两菌丝有时以短分枝相联结，菌丝表面细胞为褐色，内部土白道浅褐色。分枝有性态为亡革菌属（Thanatephorus），常不发生。常见的有立枯丝核菌（R. solaniKhn.），引致多种植物立枯病(如图8)。链格孢属（Alternaria alternata）属半知菌纲，链孢霉目，黑霉科.。链格孢属分生孢子顶部小膨大，分生孢子梗顶部有1个至多个孢痕，分生孢子呈典型的倒棒状，分隔处隘缩明
15、显或不明显，一般成链，为褐色。菌丝灰色至黑色，多成直角分支，菌丝形成隔膜，隘锁状。生长迅速，扩散快（如图7） 。图 7 链格孢属的菌丝和孢子 图 8 丝核菌的菌丝42.4 生防菌预防结果与分析通过 F19、F18、F2 三种生防菌从三个空间方向对链格孢属病原菌的长势的影响，可以比较出这三种生防菌的抑制效果。本次试验得出 F19、F18、F2 三种生防菌对上诉病原菌均有抑制作用，其中 F18 的抑制作用最强。因为细菌与真菌存在着竞争关系，生物防治主要是利用有益微生物对病原物的各种不利作用，来减少病原物的数量和削弱其致病性。有益微生物产生抗菌物质，抑制或杀死病原菌，还能诱导或增强植物杭病性，通过改
16、变植物与病原物的相互关系，抑制病害发生。有益微生物对病原物的不利作用主要有抗菌作用(antibiosis)、溶菌作用(Lysis)、竞争作用 (competition )、重寄生作用 (hyperparasitism )、捕食作用 (predation )相交互保护作用(crossprotection )等（如图 9） 。图 9 生防菌与病原菌的相互作用3 结论与讨论大血藤因其较高的药用价值和观赏价值而被越来越多国内的专家、学者所研究，他们大多是研究它的化学物质成份，药用成份，也有少数学者研究了它的病虫害鉴定及药物防治。本次研究通过科学合理的实验方法证实了药用大血藤当前导致病害的病原菌为丝核菌
17、和链格孢属，并改了以往传统的药物防治采用生物防治，取得了良好的效果，为大血藤真菌病害的预防和鉴定提出了一定的理论依据和科学基础。丝核菌是一种不产生任何无性孢子，以菌丝或菌核形态存在于自然界的土壤习居菌，其中大部分是重要的植物病原菌。该菌的菌核可以残留在土壤的表面，在土壤存活 2-3 年，遇到足够的水分和较高的湿度时，菌核萌发出菌丝通过雨水，土壤中的水的流动传播蔓延，病菌的菌丝直接侵入叶片，破坏叶肉组织，造成叶片收缩、干枯或萎焉，随之渐渐枯死。链格孢霉菌丝，大量存在于土壤、空气和作为培养料的各种有机基质上，其孢子通过空气传播。在灭菌不彻底，无菌操作不严及培养料含水量偏高和温度大的条件下，有利于发
18、生。该属引起多种水果蔬菜等黑腐病，这种真菌在很广的范围内均可以生长良好，甚至在2 的低温条件下也可缓慢生长，链格孢可通过机械伤口、冷害损伤及衰老组织的自然开孔侵入，甚至也可以通过健康的表皮。每逢 4 月到 7 月，黔东南地区多雨高温，正是这两种病原菌的繁殖期和生长期，大量茂盛的叶片也同样遭受着病害的威胁，严重的影响了植物的生长。下面基于丝核菌和链格孢属的生长条件提出一些防治措施。（1）农业措施：合理规划，规范管理。种植前进行土壤灭菌，培育无毒无病幼苗。采用大棚种植的，应合理规划好植株与植株见得距离，行与行的距离，做到通风透光。建立良好的灌溉系统和排水系统，以减少病原菌的传染。入秋后注意落叶的收
19、集，统5一处理，可进行燃烧。（2）生物防治：在幼苗种植后，可每月喷洒一次 F19、F18、F2 三种生防菌，依情况喷洒一定的次数和量。6参考文献目录1张国辉。大血藤炭宜病的病原鉴定及病害分析J.中国农学通,2012(15)2张智仙.大血藤化学成分研究(11)J.中草药,2010-06-123董玲.血藤的化学成分J.北京中医药大学学报,2009-12-154金则新.大雪藤叶的生长及光合生理生态特性研究J.植物研究,2002-04-205王宇歆.大血藤、牡丹、赤药有效组分间对肠道致病菌体外抑菌的协同作用J.中国中西医结合外科杂志.2008-08-206汤建.野生大血藤水溶性部位中的糖苷类化合物J.
20、中国天然药物,2012-03-207盛仙永.大血藤属植物研究进展J.西北植物学报,2003-07-308王华锋.大血藤生殖生物研究J.西北植物学报,2007-10-159冯改利.DPPH 法筛选大血藤抗氧化活性有效部位M.陕西中医,2011-09-0510李钧敏.大血藤 DNA 提取及 RAPD 研究初探J.植物研究,2002-10-2011韩德承.败毒杀虫大血藤J.中国中医学报,2012-05-2512邵红.不同产地大血藤次生代谢产物含量比较J.2006-05-3013施伶俐.正交实验法优选大血藤提取工艺M.安徽中医学院学报，2012-03-2014张白.鸡血藤与大血藤的区别J.中国中医现代远程教育，2006-04-0115张宏意.大血藤的 rDANITS 序列分析J.广西植物，2008-11-151致谢不知不觉中四年已逝，大学生活已近结束，我也将要离开歌的世界舞的海洋-美丽黔东南。在我的学士学位论文即将完成之际，我真诚地感谢美丽的凯院，感谢一路陪我走过来的老师、同学和朋友们，感谢我的论文指导老师张国辉老师，感谢如花儿的青春。
