1、细胞治疗用无血清培养基国内外现状,邵 宁 生,CIK 和 DC细胞,CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达 CD3 和 CD56 两种膜蛋白分子，故又称为NK 细胞（自然杀伤细胞）样 T 淋巴细胞，兼具有 T 淋巴细胞强大的抗瘤活性，和 NK 细胞的非 MHC 限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同 “ 细胞导弹 ” ，能精确 “ 点射 ” 肿瘤细胞，但不会伤及 “ 无辜 ” 的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除
2、残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此， CIK 细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。 DC(树突状细胞)：一个独特的调控初始免疫反应的白细胞群落。,免疫细胞培养的一般操作步骤,CIK细胞培养：1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）；或根据标准的外周血单个核细胞解冻程序，在37C的水浴，快速解冻（ 0.05). The cells which secreted IFN-gamma increased, while the cells which secreted IL-4 did not. The cells which secreted granz
3、yme B and perforin were positive.CONCLUSION: It is an effective and simple way to cultivate the CIK cells with RN, which should be adopted.,中国肿瘤生物治疗杂志 2012年03期 加入收藏 获取最新 两种不同成分培养基制备CIK细胞的生物学特征郑秀娟 刘荣军 李丽 张一评 汪强 【摘要】：目的:采用细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell,CIK cell)培养基(含低浓度IL-2、IFN-、IL-12和anti-C
4、D3)和NK培养基(含高浓度IL-2和anti-CD3)体外刺激诱导CIK,分析CIK细胞的扩增、表型和细胞因子分泌情况。方法:健康自愿者来源的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),分别加入CIK培养基和NK培养基进行诱导培养,24 h后,换用含IL-2的1%自体血浆培养基继续诱导培养2周。在培养的第6天和第10天检测培养上清中IFN-的分泌情况,在培养的第10天以流式细胞术检测两组培养细胞表面CD3、CD4、CD8、CD16、CD56的表达情况。结果:CIK培养基和NK培养基均可使培养细胞在第7天时开始明显扩增,第10天时可扩增至2
5、00倍。其中,CIK培养基获得的细胞扩增倍数明显高于NK培养基,其IFN-分泌明显高于NK培养基组(724.7434.8)vs(108.960.6)pg/ml,P0.01;而以NK培养基培养的细胞,CD3-CD16+CD56+细胞比例高于CIK培养基(6.273.33)%vs(2.881.88)%,P0.05。结论:不同成分的CIK培养基和NK培养基均可促进CIK细胞的扩增和成熟,但呈现不同的生物学特征。【作者单位】： 上海复仁生物科技有限公司;,硕士毕业论文,无血清培养DCs激活的CIK治疗肝癌的体外实验研究论文摘要:目的: 1.建立一套高效的无血清体外制（略）的方法,为DCs疫苗的临床应用
6、提供实验依据. 2.探讨DCs对CIK增殖和杀伤肝癌细胞的影响. 方法: 1.采集脐血,分离其中的单个核细胞,用无血清DCs培养基(SFM)/含（略）的RPMI-1640培养基(SM),并添加rhGM-（略）IL-4联合诱导单个核细胞分化为未成熟DCs,第5天添加肝癌细胞冻融抗原,TNF-等促成熟因子,第7天收获成熟DCs,以倒置显微镜观察DCs的细胞形态,流式细胞仪测定Des表面标志物的表达;并从细胞形态和（略）方面比较用无血清DCs培养基(SFM)/含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基(SM)培养的DCs. 2.用细胞因子-IFN、IL-2、CD3-Ab、IL-1a诱导脐血单个核细胞为
7、CIK,第7天DCs和CIK共同培养.采用MTT法（略）养基和含5%胎牛血清的培养基产生的DCs刺激CIK的促增殖效应和DC-CIK对肝癌细胞的杀伤效应. 结果: 1.无论采用无血清树突状细胞培养基(SFM)还是含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基,脐血来.,间充质干细胞（MSC）培养,人骨髓：抽取骨髓10-15ml（或正常人手术肋骨取骨髓3-5ml），每毫升骨髓加100u 肝素抗凝，充分混匀后，保存于4冰箱，24小时内分离骨髓MNC。骨髓先加入等量 PBS或Hanks液（或培养液）混匀后，以1份淋巴细胞分离液上面加2份稀释骨髓的比例，将稀释骨髓缓慢加入ficoll液面上（密度1.077）
8、，水平离心机20条件下500g（2000r/min）离心2530分钟。从界面上取出的MNC用PBS液洗涤23次后，加适量培养液计数。（3）数细胞数量，达到106107/ml后即进行原代培养，按5106/ml 浓度接种于50ml培养瓶中（1106/cm2培养瓶），每瓶含5ml L-DMEM完全培养液。在体积分数为5%的CO2和37条件下静止培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每34d半量换液1 次，1012d细胞达90%融合时传代。（4）传代培养：传代时先全部吸出培养液后，用无Ca2+ 、Mg2+PBS液洗涤二次，加入37 预热的0.25%（2.5g/L，0.25%）胰蛋白酶（含1mmol/L
9、EDTA，即用1mmol/L-EDTA-Na2配制）消化12分钟，吸去胰酶，以残留的胰酶继续消化，倒置显微镜下观察，细胞开始皱缩时（细胞开始变圆）加入完全培养液（3ml左右）终止胰酶作用。吸管反复吹打后将细胞收集于15ml离心管中，1500r/min 离心10分钟后弃上清，再用PBS液洗涤二次彻底洗去混有的胰蛋白酶。将细胞再悬浮于培养液中，按25105/ml再次接种传代于新的培养瓶中。当这些细胞生长接近融合层时，即得到骨髓 MSC。传至35代的MSC按1105cells/cm2密度接种于放置有盖玻片的6孔板内，以制备细胞爬片。,贴壁细胞的消化，应掌握各类型细胞不同的消化时间，避免过度消化，损伤
10、细胞活力；或消化不足，不能充分解离成单细胞。如为长期实验，每个月重新复苏一支细胞，避免长期传代引起细胞特性变异。,间充质干细胞（MSC）培养基,目的是人间充质干细胞 (hMSC) 生长和扩增有效避免人畜共染疾病问题，同时无血清细胞培 养基批间差异小，培养条件容易保持一致，实验 的重复性大为提高。 使细胞大量增殖、不分化。,STEMPRO hESC SFM人间充质干细胞培养基 STEMPRO hESC SFM第一款无血清培养基 (SFM)，专为人间充质干细胞 (hMSC) 生长和扩增而开发出众的扩增效率 更高品质的人间充质干细胞 更佳的批间一致性第一种适合 hMSC 的无血清培养基在高细胞密度下
11、实现高效 hMSC 扩增 需要较少的培养基、表面积，节省时间 更优质的细胞 传代 5 次之后仍具有原始表型，保持 hMSC 表面标志物表达，具有正常的基因表达谱，并且保持 CFU-F 和三系中胚层分化能力 批间一致性高 - 在 cGMP 条件下生产，通过 hMSC 性能分析进行认证 无需或仅需少量驯化，即可从添加血清的培养基改为使用此产品高细胞密度下的优异 hMSC 扩增扩大 hMSC 的产量对于任何活细胞治疗而言都至关重要。 采用STEMPRO MSC SFM可实现100万至10亿个hMSC细胞的扩增，与经典培养基 (DMEM + 10% MSC经过质量认定的FBS) 相比，培养基用量减少8
12、5%，表面积减少92%，时间缩短16%，传代次数和精力减少25% (反应板用量和传代次数减少，无需预先经过认证的FBS) (表1),Invitrogen,CELLstart - 适用于无血清 hMSC 的培养基质 CELLstart可与STEMPRO MSC SFM配合使用，当hMSC细胞在无血清条件下培养时，用以支持hMSC细胞的粘附。 CELLstart是第一款无外源成分基质，可用于干细胞的培养，其按照cGMP要求生产，批间品质一致。,Invitrogen,GIBCO A10332-01 间充质干细胞无血清培养基StemPro MSC SFM,Developed for Human Mes
13、enchymal Stem Cell CultureStemPro MSC SFM is a serum-free medium (SFM) specially formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells (MSCs). StemPro MSC SFM enables superior human MSC growth and increased consistency compared to classical serum-supplemented medium (DMEM + 10% FBS
14、). Using StemPro MSC SFM, human MSCs can be expanded beyond 5 passages while still maintaining their tri-lineage mesoderm differentiation potential (i.e., ability to differentiate into osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineages). Each lot of StemPro MSC SFM is qualified using a human MSC perfo
15、rmance assay and human MSCs growing in serum-supplemented medium can be transitioned directly into StemPro MSC SFM with little or no adaptation required. In addition, StemPro MSC SFM facilitates expansion of MSCs directly from primary human bone marrow.For human ex vivo tissue and cell culture proce
16、ssing applications. CAUTION: Not intended for direct administration to humans or animals.,人脂肪间充质干细胞无动物源培养基百恩维的人脂肪间充质干细胞无动物源培养基根据人脂肪间充质干细胞的生长需要，培养基包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质以及其他补给成分。非常适用于培养人脂肪间充质干细胞。产品严格无菌，无病毒和支原体，性能稳定，使用该培养基能使人脂肪间充质干细胞在理想营养平衡状态下进行多代扩增而不发生分化（至少10代以内）。 产品货号BW110025,人间充质干细胞
17、生长无血清培养基,LONZA 00190632 MSCGM-CD BulletKit 人间充质干细胞无血清培养基评价或评论上海华雅思创生物公司销售的TheraPEAK Chemically Defined Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 人间充质干细胞无血清培养基是从美国原装进口的，由美国LONZA公司旗下的BioWhittaker公司专门针对人间充质干细胞(MSCs)研发的特定细胞培养基。美国BioWhittaker公司作为美国最早的人体和动物细胞培养基的供应者，进入生物医药已有50年的历史（1952年成立）。美国BioWhittaker公司的细胞培养
18、产品主要有特定细胞的原代细胞生长培养基，通用无血清培养基，特殊用途无血清培养基，普通培养基，无蛋白和限定化学成分培养基等细胞培养基类产品和内毒素检测试剂盒等生命科学产品。1997年美国BioWhittaker公司成为美国Cambrex公司旗下子公司，继续服务于欧美及全球生命科学市场。为了研发更多优质产品，2007年BioWhittaker公司加盟LONZA集团，同时LONZA集团为其BioWhittaker子公司提供了雄厚的资金和高端的技术支持。为此，LONZA品牌的细胞培养类和内毒素检测类产品将以更优异的产品质量和便捷的服务提供给广大用户。LONZA TheraPEAK Chemically
19、 Defined Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 人间充质干细胞无血清培养基已经在欧美及中国科研市场广泛使用多年，具有在高细胞密度下实现高效 hMSC 扩增；人间充质干细胞(hMSCs)传代5次之后仍具有原始表型，保持hMSC表面标志物表达，具有正常的基因表达谱，并且保持CFU-F和三系中胚层分化能力；在cGMP条件下生产，通过 hMSC 性能分析进行认证，保证极小的批间差；无需或仅需少量驯化，即可从添加血清的培养基改为使用此产品。上海华雅思创生物科技有限公司在上海仓库备有少量现货，并严格按照产品的最佳储存条件进行储存与管理，我们的一贯宗旨是：更用心地为
20、中国广大科学研究工作者提供更安全、更放心、更便捷的服务。欢迎您来咨询与购买LONZA TheraPEAK Chemically Defined Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 人间充质干细胞无血清培养基！,人间充质干细胞无血清培养基 - 上海依科赛生物制品有限公司注明研究用，不能用于人的诊断与治疗,存在的问题及我们的思路,国内外品牌宣传的好，其实效果不佳，不能从开始做到无血清培养，细胞扩增。国内有些无血清配方添加生长因子，如FGF，能扩增，但是引起细胞分化。国内医院都是前期有血清培养，后期洗涤细胞，生理盐水分装。第一阶段：参照目前方法或改进型第二阶段：自
21、主创新真正意义上的无血清培养。,J Clin Immunol. 2011 Dec;31(6):1143-56. doi: 10.1007/s10875-011-9581-z. Epub 2011 Sep 2.Immunomodulative efficacy of bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in human platelet lysate.Flemming A, Schallmoser K, Strunk D, Stolk M, Volk HD, Seifert M.SourceInstitute of Medica
22、l Immunology, Universittsmedizin Charit, Campus Virchow Klinikum, Augustenburger Platz 1, 13353, Berlin, Germany.AbstractHuman mesenchymal stem cells (hMSCs) are considered to be a promising tool for novel cell-based therapies. Clinical applications in solid organ transplantation were hampered by th
23、e dependence on animal serum for hMSCs clinical scale expansion until substitution with human platelet lysate (HPL) became a promising alternative. Therefore we focused on a direct comparison of immunomodulatory properties of hMSCs cultured in HPL or fetal calf serum (FCS). Phenotypic characterizati
24、on, detection of cytokine secretion and effects on alloantigen- and mitogen-induced lymphocyte proliferation as well as degranulation of cytomegalovirus-specific cytotoxic T cells were applied in potency assays. We demonstrated that HPL-cultured MSCs have comparable immunomodulatory capacities to th
25、eir FCS-cultured counterparts. The observed immunomodulatory properties include a beneficial inhibitory effect on immune cell proliferation and an unaffected viral T cell immunity. Thus, culturing hMSCs in HPL generates an efficient and safe expansion combined with intriguing immunomodulatory properties making these cells an attractive cell therapeutic tool.,
