1、植物组织培养学,Plant tissue culture,2017年春学期阜阳师范学院生物与食品工程学院QQ群 110953973,2018/7/19,2,第四章 植物器官培养,第一节 概述 第二节 营养器官培养第三节 繁殖器官培养,2018/7/19,3,植物器官培养（Organ Culture）是指对植物某一器官的全部、部分或器官原基进行离体培养的技术。分为营养器官（根、茎、叶）和繁殖器官（胚胎、种子、花器官）培养。,第一节 概述,2018/7/19,4,外植体形态发生形成完整植株的途径（一）外植体-愈伤组织-完整植株。 具体又可分为三种： 1、愈伤组织-同时长芽和根-植株。2、愈伤组织-
2、茎-根-植株。3、愈伤组织-根-芽-植株。4、愈伤组织-体细胞胚-植株,第二节 营养器官培养,2018/7/19,7,一、离体根的培养二、茎尖的培养*三、茎段的培养四、离体叶的培养*,一、离体根的培养 （一） 意义： 生理代谢研究的优良实验体系 研究器官分化形态建成的良好体系 建立快速生长的根无性系 进行诱变育种,2018/7/19,8,1. 培养基选择 White培养基；2/3或1/2 MS 和 B5培养基 注：离体根生长要求提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好，加入VB1、VB6最重要，生长素对离体根影响不一致。培养温度2527，暗光培养。,2018/7/19,9,（二） 培养方法,离体根
3、生长的营养要求1、无机成分 要求培养基中有全部必要元素，因为它是离体生长所需要的，一般的为MS、B5培养基。2、氮源 氮源有铵态氮、硝态氮和可溶性有机氮如氨基酸或酰胺等，其中以硝态氮的效果最好。加入含各种氨基酸的水解酪蛋白，能促进离体根的生长。,3、碳源 以蔗糖的效果最佳，几乎为葡萄糖的10倍。蔗糖的浓度为23%。4、维生素 维生素以B1和B6最为重要，缺少它根的生长受到阻碍，而加入它可使根的生长成倍的加快。B1的使用浓度为0.1-1.0mg/L为宜。5、生长物质 对离体根的生长而言，生长素的效应最为明显，在一般情况，加入适量的生长素能促进根的生长，其反应和需要量因植物种而异：6、温度和光照
4、黑暗有利于根的形成，温度一般在16-257、PH 根发生和生长所需的PH范围一般为5.0-6.0,2. 无性繁殖系的建立 种子消毒 接种待根伸长后从根尖一端切取长1.2cm的根尖接种于培养基发育出侧根待侧根生长约1周后切取侧根的根尖进行扩大培养又迅速生长并长出侧根切下进行培养，如此反复得到从单个根尖衍生而来的离体根的无性系。 3. 培养条件 暗光和温度25-27。,2018/7/19,12,4、根的间接增殖第一步在脱分化培养基上诱导形成愈伤组织，如胡杨的根段培养，可诱导形成白色愈伤组织。第二步在再分化培养基上诱导形成芽的分化，如胡杨从绿色愈伤组织分化出小植株。,一、离体根的培养,胡萝卜根培养,
5、5、培养方式 离体根的培养方式有三种类型。 第一种固体培养法，即将根尖接种在固体培养基上，根依靠培养基中的养分和生长物质而不断生长。 第二种是液体培养法，把根尖接种在无琼脂的液体培养基中，经常振荡使根获得充足的氧气。 第三种是固体-液体培养法，就是把根基部插入固体琼脂培养基中，根尖浸在液体培养基中，根尖生长而根不断的伸长和分枝。,2018/7/19,16,二、茎尖的培养*,（一）茎尖培养概念及类型（二）病毒在植物体内的分布（三）茎尖培养方法及步骤,(一)茎尖培养概念及类型 茎尖培养：切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行无菌培养。 茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为： 微茎尖培养: 带有1
6、-2个叶原基的生长点, 其长度不超过 0.5mm。,2018/7/19,17,普通茎尖培养：较大的茎尖(如几mm到几十mm)、芽尖及侧芽。 这里主要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作方便，茎尖容易成活，成苗所需时间短 。 茎尖培养的意义： 普通茎尖培养技术简单，操作方便，易成活，成苗 时间短，加快繁殖。 微茎尖培养可获得脱毒苗；,2018/7/19,18,病毒侵染植株的叶片后，经过一段时间，即向附近的细胞增殖转移。转移速度很慢，每小时只有几微米。当叶片内病毒浓度增大到一定量时，就转移到韧皮部，随后通过维管束转移到其它部分。由于病毒转移速度慢，加上茎尖分生组织无维管束，病毒只能通过胞间连丝传
7、递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以生长点的病毒数量极少，几乎检测不出。茎尖培养时，切取的茎尖越小，带病毒的可能性就越小。茎尖脱毒的基本原理,(二)病毒在植物体内的分布,（三）茎尖培养方法及步骤,2018/7/19,21,直接取材：在生长旺盛、枝条健壮、无病的母株上选生长不久、杂菌污染少的顶梢（12cm）（取前可喷杀菌药，可顶芽或侧芽）。从试管苗获取。,2018/7/19,22,1、 取材,取1-2顶梢,2018/7/19,23,2、材料处理及消毒,将采集到的茎尖切成0.5-1.0cm长去叶（休眠芽预先剥除鳞片） 流水冲洗2-4h 75的酒精中处理30s 稀释20倍的次氯酸钠中浸5-8min(
8、取自老枝条上的可适当延长时间）用无菌水冲洗数次，准备接种。,3、接种 接种前再剥掉一些叶片，使茎尖0.5cm 接种 要求：随切随接，动作迅速。 亦可将切下茎尖材 料在15% VC液中浸一下。,2018/7/19,24,4、培养的方法和程序（1）培养基 基本培养基 MS、White、 B5、 Heller培养基。 蔗糖作碳源效果好，浓度23%。 激素（ 2，4-D，IAA， NAA ）和有机添加物有明显影响。但激素浓度以0.1mg/L为宜，不要太高。,2018/7/19,25,生长太慢：茎尖不增大变绿细胞逐渐老化休眠 原因: 生长素浓度太低；温度过低或过高；生长太快：茎尖迅速增大愈伤组织丧失成苗
9、能力 原因: 生长素浓度过高；光照太弱或温度太高； 生长正常：茎尖基部稍增大并形成少量愈伤组织，茎尖颜色 逐渐变绿，并伸长，叶原基发育成可见的小叶， 进而形成小苗。,2018/7/19,26,茎尖生长状态,（2）初代培养条件 每天 光照16h， 光强度1500-30001x， 温度252,2018/7/19,27,（3） 继代培养 茎尖长成的新梢切成小段增殖培养基中 1个月左右新梢又可切成小段再转入新培养基建立和维持了茎尖无性系。 （即微型扦插） 继代培养可用MS培养基。,2018/7/19,28,（4） 诱导生根 采用12MS培养基 加入一定的生长素类调节物质，如NAA、IBA等。新梢基部浸
10、入50或100mg/l的IBA溶液处理4-8h，然后转移到无激素的生根培养基中。,2018/7/19,29,(5) 驯化移栽入土 在生根培养1个月左右生长健壮而发达的根系炼苗移栽 管理（温、光、湿、气）,2018/7/19,30,指不带芽和带一个以上定芽或不定芽（包括块茎、球茎在内）的幼茎切段的无菌培养。,2018/7/19,31,三、茎段培养,茎段培养用于快速繁殖的优点,培养技术简单易行，繁殖速度较快，每年可增殖105-1012株苗；加速良种和珍贵植物的繁殖，芽生芽方式增殖的苗木质量好，且无病，性状均一；解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖的问题，且可节省种株；试管苗便于运输和防止种苗
11、带菌传播，有利于国际种质交流；试管苗可用于保存某些难以用种子保存的种质资源。,（一）定义： 离体叶培养指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。 它大多经脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织分化出芽和根。 其中叶片培养是一个典型的代表。,2018/7/19,33,四、离体叶的培养*,（二）意义： 1.是繁殖稀有名贵品种的有效手段； 2.可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题。,2018/7/19,34,（三）叶片的离体培养方法 发育方式：叶片培养再生成完整植株有两种方式： 是直接诱导形成芽和根完整植株； 是先诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织分化形成芽和根完整植株。 其中
12、，以第二种方式最为常见。,2018/7/19,35,叶片离体培养发育方式（成苗途径）,2018/7/19,36,叶原基,叶鞘,叶片,子叶,叶柄,愈伤组织,芽和根,试管苗,不定芽,1. 材料选择及灭菌 取植物的幼嫩叶片，切割成适当大小（23cm），在流水中冲洗干净。再用75酒精浸泡约10s 饱和漂白粉液中浸3-15min，或在0.1升汞中浸3-5min 无菌水冲洗数次无菌的干滤纸上吸干水分接种。 注：细嫩与成熟叶片消毒时间不同,2018/7/19,37,2.接种 外植体大小：0.5cm2 薄片（叶柄、子叶）上表皮朝上接种培养基。最好带叶脉，注意极性,2018/7/19,38,3.培养 （1）培养
13、基： MS、B5、White 、N6；蔗糖3%； 2.4D利于愈伤组织形成，NAA抑制芽形成，利于根发生，KT、6-BA利于芽形成。 愈伤组织诱导：BA 1-3mg/L,NAA 0.25-1mg/L； 分化培养：CTK 2 mg/L； 生根培养：NAA 0.51.0 mg/L,2018/7/19,39,(2)培养过程： 培养约2周至4周形成愈伤组织再分化培养基上（附加6-BA 2mgL ）进行分化培养约10d左右，愈伤组织开始转绿出现绿色芽点发育成无根苗生根培养基（附加 NAA0.5-l mg/L ） 发育形成完整植株。,2018/7/19,40,(3)培养条件： 温度：252 光照时间：10
14、-12h， 光照强度：1500-3000 Lx 。,2018/7/19,41,叶的培养比胚，茎尖和茎段培养难度大。 首先要选用易培养成功的叶组织，如幼叶比成熟叶易培养，子叶比叶片易培养。 其次要添加适当的生长素和细胞分裂素，保证利于叶组织的脱分化和再分化。,2018/7/19,42,第三节 生殖器官的培养,2018/7/19,43,一、花器官的培养二、种子的培养三、胚胎的培养*,2018/7/19,44,一、花器官的培养,1. 定义： 花器官培养指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。,2018/7/19,45,一、花器官的培养（花蕾）,2、意义： 通过离体花芽
15、培养可了解整体植物和内源激素在花芽性别决定中所起的作用 可以了解花器各部分对果实和种子发育的作用 内、外源激素在果实种子发育过程中的调控作用 生产上也可用于珍贵品种的扩大繁殖。,2018/7/19,46,2018/7/19,47,二、种子培养,2018/7/19,48,定义： 种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的未成熟种子的无菌培养。,2. 意义 ：可以打破种子休眠，促进萌发； 通过胚胎拯救解决远缘杂种败育性，产生后代；快速繁殖苗木 优点：植株分化容易，无菌操作方便,2018/7/19,49,定义：植物胚胎培养是指对植物的胚(幼胚、成熟胚)、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育
16、成完整植株的技术。,2018/7/19,50,三、胚胎的培养*,胚胎培养已有近百年的历史：1904年的Haning最早成功地培养了萝卜和辣椒的胚，并萌发形成小苗。30年代成功地把兰科植物的胚培养成小植株。40年代在苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、甘蓝与大白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养及子房与胚珠培养均取得了不同程度的进展,2018/7/19,51,（一）胚胎培养的意义克服远缘杂种的不育性 ；使胚发育不全的植物获得后代； 缩短育种年限 ；研究与胚发育有关的内外因素。,2018/7/19,52,（二）离体胚培养 离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，一般可分为成熟胚和幼胚培养。,
17、2018/7/19,53,1.成熟胚培养 指子叶期后至发育完全的胚。培养较易成功，在含有大量无机元素和糖的基本培养基上，就能正常生长成幼苗。将成熟或未成熟种子用70酒精进行几秒钟的表面消毒无菌水冲洗3-4次无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养。,2018/7/19,54,培养基：White Tukey MS无机盐+糖(1-2%)+生长辅助物质(激素、AA、活性炭、维生素等),2018/7/19,55,幼胚是指子叶期以前的幼小胚。由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，其研究应用越来越深入广泛。幼胚培养技术：心形期胚或更早期的胚（长度仅0.10.2mm）胚越小就越难培养 ,
18、幼胚培养成功的有大麦、荠菜、甘蔗、甜菜、胡萝卜等,2018/7/19,56,2. 幼胚（未成熟胚）培养：,（1）未成熟胚胎的培养有三种不同的发育方式：a. 继续进行正常的胚胎发育，维持“胚性生长”；b. 早熟萌发，即培养后迅速萌发成幼苗；c. 胚在培养基中发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。,2018/7/19,57,（2）幼胚培养技术幼胚培养的操作方法与成熟胚培养方法基本相同。值得注意的是切取幼胚必须在高倍解剖镜下进行，操作时要细心，尽量取出完整的胚。幼胚培养成功的关键，是提供幼胚所必需的营养和环境条件。,2018/7/19,58,培养基 幼胚对培养基要求较高，常用
19、的培养基有Tukey，Nitch、 MS，B5培养基；,2018/7/19,59,通常存在的影响条件如下：,生长调节物质 不同植物的胚培养需要的生长物质不同。如IAA可明显促进向日葵胚的生长；IAA，Kt的共同作用可促进荠菜幼胚的生长；一般认为IAA可使胚的长度增加；加入BA可提高胚的生存机会；,2018/7/19,60,天然提取物的作用 椰乳对胚培养有一定的促进作用（番茄胚在含有50%椰乳的培养基中可维持生长 ）一些瓜类的胚乳提取物能促进胚生长的能力。,2018/7/19,61,温光条件 对于大多数植物的胚来说，在25-30为宜 早熟果树如桃的种胚，必须经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长
20、，而马铃薯胚以20为好。光照可以促进某些植物胚的转绿，利于胚芽生长，而黑暗则利于胚根生长。因此以光暗交替培养较为有利。,2018/7/19,62,其它条件 胚培养中除要求较高的蔗糖（4.5%）浓度、高渗透压以外，还要求较高浓度的氨基酸及无机盐。,2018/7/19,63,2018/7/19,64,(三)胚珠培养,.定义：胚珠培养是将授粉的子房在无菌条件下解剖后，取胚珠置于培养基培养的过程。有时也把胚珠连同胎座一起取下来培养。,2018/7/19,65,花组成,2018/7/19,66,2018/7/19,67,2.意义： 胚珠培养可以解决象兰科植物成熟胚较小不易培养的问题。 另一方面在未受精的
21、胚珠培养中，可诱发大孢子发育成单倍体，用于单倍体育种。,3.培养技术： 从花中取出子房 70%酒精消毒30秒 无菌水冲洗 5%次氯酸钠液中灭菌10分钟 无菌水冲洗数次 在无菌条件下进行解剖 取出胚珠 放在培养基上 培养 基本培养基：用Nistch培养基 MS、N6、B5等培养基也可采用 关键：选择胚的发育时期球形胚期的胚珠较易培养成功,2018/7/19,68,4.发育方式：,2018/7/19,69,(四)子房培养,2018/7/19,70,1.取材： 开花前15天摘下未授粉子房； 或授粉后摘下子房。2.灭菌： 材料处理(禾谷类植物用70%酒精擦洗幼穗；双子叶植物花蕾用饱和漂白粉灭菌15分)
22、 70%浸30秒 无菌水冲洗 0.1%升汞1520分钟 无菌水冲洗 无菌滤纸吸干。,3.接种： 无菌条件下剥开幼花，夹出子房并接种于培养基（MS、N6等）。4.培养： 温度26,相对湿度50-60%，16h散射光。,2018/7/19,71,胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的三倍体组织。 由它可获得无子结实的三倍体植株，进而可将它加倍成六倍体植株。,2018/7/19,72,(五)胚乳的培养,培养方法： 1. 取材与接种 取授粉4-8d后的幼果常规消毒在无菌条件下切开果实 取出种子 分离出胚乳 接种 2. 培养基: MS、White + 2，4-D（NAA，0.5-2.0mg/L
23、 ） + 6-BA，0.1-1.0mg/L,2018/7/19,73,3.培养 在25-27，黑暗条件或散射光下培养约6-l0d胚乳开始膨大形成愈伤组织分化培养基上（ 附加6-BA， 0.5-3.0mg/L，少量的NAA ）培养 待愈伤组织长出芽后，取下不定芽生根培养基光下培养10-15d，切口处可长出白色的不定根。,2018/7/19,74,2018/7/19,76,第4节 植物组织与器官培养 实例,植物组织培养：将离体的植物组织（器官、细胞、胚胎、原生质体）等在适当的培养条件，长成完整植株的技术。诱发产生愈伤组织、潜伏芽植物器官培养：将诱导的或植株上原有的各种器官，放在无菌的人工环境中让其
24、进一步发育，最终长成幼苗或大量繁殖的过程。,植物离体无性繁殖,简称离体繁殖（in vitro propagation)、微型繁殖（micropropagation)，是指利用离体培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，并在短期内获得大量遗传性一致的植株的方法（技术）。用这种方法得到的植株群体称单株无性系。(来自一个单株（或一个单芽），它们遗传组成相同),近400种植物离体繁殖已获成功。兰花、无子西瓜、马铃薯、杨树等已在种苗生产上广泛应用。,植物离体无性繁殖的意义（优越性）,繁殖速度快，经济效益高,占用空间小，不受地区季节限制，便于工厂化育苗,可以繁殖各种珍
25、稀、涉危苗木,离体繁殖周期：13个月繁殖系数：几十几百倍又称快繁,离体繁殖是建立在体细胞系的基础上，是在人工控制的环境条件下，不会造成性状分离，也不会退化，同时还可避免病虫害的侵染。,利于筛选突变体，为育种服务,手指玫瑰,由根组织培养的蒲公英幼苗,植物离体无性繁殖的方式,器官发生型(organogenesis type)胚状体发生型(embryogenesis type)不定芽型（adventitious bud type)器官型(organ type)原球茎型(protocorm type)球茎芽型 块茎型鳞茎型孢子型根茎型 微枝扦插型,器官发生型(organogenesis type)：,
26、诱导器官外植体产生愈伤组织，经分化培养形成芽、根再生成植株的方式。技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早期挑选，使其来源尽量一致。特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。,芦荟、烟草、油菜等,2018/7/19,82,无菌母株制备,增殖、分化,植株再生及鉴定,炼苗和移植,培养基中激素配比,激素种类及浓度,基本培养基组成,渗透压,逐步过渡,培养基筛选,材料灭菌,胚状体发生型(embryogenesis type)：,指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱分化形成胚状体再成苗的方式。技术关键：提高不同外植体胚状体发生及萌发率和提高胚状体同步化率。特点：胚状体发生数量
27、多、速度快、结构完整，繁殖系数高；遗传性稳定。,甘蔗、胡萝卜、石刁柏等,不定芽型（adventitious bud type)：,选取具有顶芽和腋芽的短枝无菌培养，诱导芽萌发成苗或增殖产生许多不定芽发育成苗，将新萌生的枝条再转接继代，重复芽到苗的增殖过程，最后使其生根形成植株的方式。技术关键：打破顶端优势，促使腋芽增殖并促其生根。特点：繁殖率高、保持物种的遗传稳定性，多用于林木的繁殖。,FLash,器官型(organ type),指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球茎、小块茎）产生再生成植株的方式。技术关键：对培养基要求高，控制好激素浓度，避免愈伤组织发生。
28、优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定。,三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、丝石竹等,原球茎型(protocorm type),兰属特有的方式，即外植体经培养产生原球茎，再直接长成植株。,球茎芽型,叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根,遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植,唐菖蒲,观叶海棠,块茎型,叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分化出芽和根块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖移栽，成活率高 。花叶芋,鳞茎型,鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎 在试管内形成小鳞茎需较长时间 百合 郁金香,孢子型,用成熟或未成熟的孢子进行培养 孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时间较长 地钱,狼尾蕨
29、,根茎型,蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为组织培养的最佳外植体 根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢子型快肾蕨等,微枝扦插型,带芽的小插条在试管内进行无菌扦插 为木本植物进行快速繁殖的主要方式 葡萄、杨树,2018/7/19,93,培养基,无机盐,无机盐,培养基的组成,大量元素(使用浓度大于0.5mmol/L)微量元素(使用浓度小于0.5mmol/L),2018/7/19,94,无机盐,2018/7/19,95,有机物,氨基酸类 重要的有机氮源维生素类 以辅酶形式参与植物细胞代谢活动，对生长、分化具有很好的促进作用 vb1， vb6糖类 主要的碳源蔗糖？天然有机添加物类 CM（椰乳）、马铃薯汁
30、、酵母提取液（YE）、番茄汁等,2018/7/19,96,蔗糖浓度分别为0、1%、5%,2018/7/19,97,调节物质,（一）生长素类 促进细胞伸长生长和分裂、诱导愈伤组织形成、促进生根，与一定量的细胞分裂素配合可诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的产生等。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAAIAA为天然植物生长素，见光易分解，高温高压易受破坏；2,4-D有抑制芽形成的作用，一般用于细胞启动脱分化阶段；诱导分化则用NAA、NBA或IAA。IBA诱导生根效果最好。,2018/7/19,98,（二）细胞分裂素类 促进细胞分裂、诱导愈伤组织或器官分化不定芽、解除顶端优势而促进侧芽增
31、殖、抑制离体组织或器官衰老。常用的有6-BA、 KT 、 ZT,6-BA,2018/7/19,99,BA分别为0, 0.1, 5mg/L,NAA分别为0, 0.1, 5mg/L,2018/7/19,100,（三）赤霉素类 主要应用GA3，促进体细胞胚发育成小植株，GA3不耐热，水溶解后不稳定，应采用过滤除菌，并用酒精溶解。脱落酸 抑制蛋白质合成，抵消和抑制上述三种激素发挥作用；诱导休眠、促进衰老和脱落。乙烯,2018/7/19,101,植物细胞工程培养基配制,培养基母液的配制大量元素一般配成10倍浓度的母液；微量元素和有机营养常配成100倍浓度的母液；混合定容时，注意药剂的添加顺序及稀释度，以
32、免沉淀；生长调节类物质不溶于水,需用不同溶剂进行溶解单独配制的试剂：铁盐与EDTACaCl2,前P28,2018/7/19,102,以KNO3为例,1L培养基需要量为19g。,在配制母液时，增加10倍量，为190g。在母液中的浓度为190g/L，即0.19g/ml,在配制培养基时，取10ml，10ml0.19g/ml=19g,回P26,2018/7/19,103,植物细胞工程培养基配制,培养基配制过程药品 按顺序混合 pH调整 加热溶解器皿 水洗 干燥 分装培养基 加塞 冷却 高压蒸汽灭菌,2018/7/19,104,常用培养基,到目前研制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的
33、培养基配方。但多数培养基配方是在几种普遍应用的培养基上演变而来的。这几种常见的培养基为是：MS、ER、B5、N6、NT、White等，其配方如下：,2018/7/19,105,2018/7/19,106,培养基分类,根据培养基无机盐含量的差异将其分为以下4类：高无机盐含量培养基（植物器官、花药、细胞及原生质体培养）；-MS较高硝酸盐含量培养基（木本、十字花科和单子叶植物的组织和花药培养）；-B5中等无机盐含量培养基（花药培养）；-H低无机盐含量培养基（生根）。-WHITE,2018/7/19,107,植物组织培养问题分析,试管苗玻璃化现象（vitrification） 是指组织培养过程中的特有
34、的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。 玻璃化苗绝大多数为 来自茎尖或茎段 培养物的不定芽。 通常玻璃化苗 恢复正常的比例很低， 在继代培养中仍然 形成玻璃化苗。,2018/7/19,108,玻璃化的解决方法,增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；减少培养基中NH4+浓度；增加光照；增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。,2018/7/19,109,褐变问题,成因酶促-酚氧化成醌及聚合非酶促-醌聚合时段初代培养继代培
35、养,2018/7/19,110, 选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。 使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。 材料预处理和细胞筛选 使用吸附剂 0.1%-0.5%的活性炭、PVP对防止褐变也有较为明显的效果。 连续转移 对容易褐变的材料可间隔1224h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。,减轻褐变现象发生的方法,2018/7/
36、19,111,微生物污染问题,原因消毒不彻底外植体消毒问题培养基及器皿消毒问题环境消毒问题无菌操作不过关,2018/7/19,112,外植体消毒问题,外植体取材 外植体(expant)是指用于离体培养的活的植物组织。来源：,2018/7/19,113,外植体消毒问题,外植体灭菌的过程：流水冲洗1020min表面消毒无菌水冲洗45次 沥水待用 Flash,2018/7/19,114,常用消毒剂消毒灭菌效果比较,2018/7/19,115,培养基及器皿消毒灭菌问题,培养基高压蒸汽灭菌所需的最少时间,2018/7/19,116,培养基灭菌,培养基组成中若含有遇热易分解物质，如 生长调节物质、维生素、
37、尿素、酶等，则必须用过滤法除菌。 过滤除菌时，使用孔径为0.220.45m或更小的细菌滤膜。 过滤除菌可利用抽滤装置或注射过滤器进行，所用器皿均应经过高压消毒灭菌，灭菌温度不超过121。,2018/7/19,117,器皿消毒灭菌,手术刀镊子平皿干热灭菌 150-160，2h,2018/7/19,118,环境消毒问题,2018/7/19,119,无菌操作问题评价下列操作正确与否,2018/7/19,120,评价下列操作正确与否,2018/7/19,121,评价下列操作正确与否,2018/7/19,122,评价下列操作正确与否,2018/7/19,123,无菌操作,无菌操作前的准备工作无菌操作台的
38、使用操作所用器械应浸泡在95%酒精中，用前需放在耐热器皿中加入少量酒精后进行灼烧，每次使用后都要灭菌。无菌操作步骤外植体的适当切割的注意事项继代培养的材料(液体材料、固体材料）,2018/7/19,124,3.1.4.4 其他问题,培养条件控制,激素水平光照：时间，强度和光质。温度：适温有利于细胞分裂与分化，而在一定范围内降低培养温度可以使细胞的质量增加；培养基昼夜变温可能有利于器官的发生。pH 通常使用的pH值的范围是5.56.5。pH7，培养物不能正常生长。气体,2018/7/19,125,激素水平的控制,生长素应用的浓度范围为0.115mg/L。在细胞脱分化过程中，启动细胞分裂形成愈伤组
39、织，以2,4-D最为有效。细胞脱分化需要高浓度的2,4-D，当胚性细胞形成转入再分化时，则需较低的2,4-D浓度。使用浓度范围为0.110mg/L。细胞分裂素既可诱导细胞分裂，又可调节细胞分化。,2018/7/19,126,16h/d,24h/d,0h/d,光照时间的影响,2018/7/19,127,液体振荡培养的愈伤组织生长与振荡频率的关系,2018/7/19,128,3.2 植物胚胎培养,Flash,2018/7/19,129,概念,花药培养属于器官培养范畴,花粉培养属于细胞培养范畴也称小孢子培养,花药及花粉培养,把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成植株的过程,从花药
40、中分离出花粉粒使之成为分散或游离的状态，通过培养使其脱分化并发育成植株的过程,2018/7/19,130,获得单倍体植株花药培养的基本程序： Flash选处于生殖生长高峰期的花药，需低温预处理（310，210天），光照先弱后强。,花药培养目的及程序,2018/7/19,131,花粉或小孢子的分离,花粉或小孢子培养目的及方法,目的：获得单倍体植株,2018/7/19,132,花药看护培养花粉悬浮培养固液双层培养,花粉培养方法,2018/7/19,133,2018/7/19,134,毛状根培养,定义：毛状根(hairy roots)是（双子叶）植株或组织、器官经发根农杆菌（Agrobacteriu
41、m rhizogenes）感染后，形成的类似头发一样的根组织。又称发状根。,1934年，Hildebrand 报道了发根农杆菌感染苹果树产生发根 。,2018/7/19,135,毛状根的特性,特性：毛状根可以不依赖激素快速生长，根多丛生，多分枝，多根毛，无向地性。生理生化和遗传稳定。为什么可以不依赖激素？发根农杆菌的Ri质粒上的T-DNA片断整合进植物细胞核基因组中。T-DNA上有生长素合成基因tms 1 和tms 2能够指导IAA的合成。,2018/7/19,136,毛状根的诱导,外植体接种法 -共培养 茎秆接种法原生质体-农杆菌共培养法,2018/7/19,137,生物反应器培养青蒿毛状根
42、生产青蒿素,青蒿：为双子叶植物药菊科植物青蒿素：,倍半萜内酯类化合物功效：治疗疟疾,2018/7/19,138,1.Bioreactor, 2.Concentric draught cylinder, 3.Stainless stell mesh, 4.Air outlet, 5.Timer, 6.Mist nozzle, 7.Medium, 8.Air inlet, 9.Air filter, 10.Flowmeter, 11. Holes on draught cylinder, 12.Electromagnetic valve, 13.Air storage tank, 14.Nebul
43、izing device, 15. 40W fluorescent lamp,2018/7/19,139,2018/7/19,140,生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素,2018/7/19,141,Growth feature of Artemisia annua adventitious shoot in the mist bioreactor (a) 0 d ; (b) 10 d ;,10cm,30cm,2018/7/19,142,生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素,实验材料青蒿毛状根：由发根农杆菌R1601诱导青蒿叶片产生培养方法及条件1. 固体培养2030 mm青蒿毛状根根尖MS固体培
44、养基(添加30 L蔗糖)继代时同为15d,2018/7/19,143,生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素,培养方法及条件2. 液体振荡培养（三角瓶）接种量：每L培养液（MS）5 g 毛状根培养物（分支多且细长的毛状根）120-130 rpm，251 ，12 hd光照液体培养的继代时间为10 d。 反应器培养反应器中的培养液(MS)为400mL，接种量为0.8g12 hd培养，25I 。雾化间隔30 min，雾化2min。通气量为0.5 Lmin，通气时间为15 mln。,2018/7/19,144,最大生物量10.3g/L，青蒿素产量达到179.1mg/L，青蒿素的含量为1.74。,2018/7/19,145,小结,外植体选择是植物组织培养的基本环节，应根据不同培养目的确定取材原则。通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？,
