1、细菌的常用生化试验,细菌室,23种细菌鉴定常用生化试验,1.碳水化合物的代谢试验（1）糖（醇、苷）类发酵试验（2）氧化一发酵试验（OF试验）（3）-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）（4）七叶苷水解试验（5）甲基红试验（6）V-P试验2.蛋白质和氨基酸的代谢试验 （1）明胶液化试验（2）吲哚（靛基质）试验（3）硫化氢试验 ）尿素分解试验（5）苯丙氨酸脱氨酶试验（6）氨基酸脱羧酶试验3.碳源和氮源利用试验 （1）枸橼酸盐利用试验（2）丙二酸盐利用试验4.各种酶类试验 （1）氧化酶试验（2）过氧化氢酶试验（触酶试验）（3）硝酸盐还原试验（4）脂酶试验（5）卵磷脂酶试验（6）DNA酶试验（7）凝固酶试验
2、（8）CAMP试验,一、碳水化合物的代谢试验,原理由于细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。具体试验有：糖类发酵试验；葡萄糖代谢类型鉴别试验；七叶苷水解试验；淀粉水解试验；甲基红试验；V-P试验；-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）。,1.糖（醇、苷）类发酵试验,原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力各不相同，细菌分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。方法：将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到糖（醇、
3、苷）类发酵培养基中，置培养箱中培养数小时至两周后，观察结果。结果：若能分解培养基中的糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。若不分解，培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。,2.氧化-发酵试验（0/F试验）,原理： 不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因是否有氧气的存在而异，有氧条件下称为氧化，无氧条件下称为发酵。方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡（或其他矿物油），高度不少于lc
4、m。将培养基于35培养48h或更长。结果：应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别，前者是发酵型，后者是氧化型。,发酵型（产酸）,氧化型,产碱型,3.-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）,原理 细菌分解乳糖依靠两种酶的作用，一种是半乳糖苷透性酶，它位于细胞膜上，可运送乳糖分子渗入细胞。另一种为-半乳糖苷酶，亦称乳糖酶，位于细胞内，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。具有上述两种酶的细菌，能在2448h发酵乳糖，而缺乏这两种酶的细菌，不能分解乳糖。方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴
5、甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37水浴5min，加入0.25ml ONPG试剂，水浴20min3h观察结果。结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在2030min内显色。应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。,4.七叶苷水解试验,原理方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。应用：主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。,5.甲基红试验,原理：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产
6、生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，培养24d，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。,6.V-P试验,原理方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，于35培养48h后加入甲液（6%-萘酚酒精溶液）和乙液（40%KOH溶液），振摇。结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出
7、现且于354h后仍如故者即为阴性。应用：本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。,二、蛋白质和氨基酸的代谢试验,原理：不同种类的细菌分解蛋白质的能力不同。细菌对蛋白质的分解，一般先由胞外酶将复杂的蛋白质分解为短肽（或氨基酸），渗入菌体内，然后再由胞内酶将肽类分解为氨基酸。具体试验有：明胶液化试验；吲哚试验（靛基质试验）；硫化氢试验；尿素酶试验；苯丙氨酸脱氨酶试验；氨基酸脱羧酶试验。,1.明胶液化试验,原理方法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于22培养7d，逐日观察结果。结果：培养基呈液化状态为阳性。应用：肠杆菌科细菌的鉴别，如沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆
8、菌等可液化明胶，而其他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外多数假单胞菌也能液化明胶。,2.吲哚（靛基质）试验,原理方法：将待检菌接种于蛋白胨水培养基中，于35培养2448h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,3.硫化氢试验,原理方法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基，于35培养2448h观察结果。结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。应用：主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴性。沙门菌属中也
9、有硫化氢阴性菌种。,4.尿素分解试验,原理方法：将待检菌接种于尿素培养基，于35培养l824h观察结果。结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性。另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性,5.苯丙氨酸脱氨酶试验,原理方法：将被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上，于35培养l824h，滴加10%三氯化铁试剂34滴，自斜面上方流下。结果：出现绿色为阳性。应立即观察结果，延长反应时问会引起褪色。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆
10、菌种中其他细菌均为阴性。,6.氨基酸脱羧酶试验,原理方法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或矿物油，于35培养l4d，每日观察结果。结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，若测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现紫色则试验无意义，不能作出判断。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴性。,三、碳源和氮源利用试验,1.枸橼酸盐利用试验原理：某些细菌能以铵盐为唯一氮源，并且利用枸橼酸盐作为唯一碳源，可在枸橼酸盐培
11、养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱性。方法：将被检菌接种于枸橼酸盐培养基，于35培养l4d，每日观察结果。结果：培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性；应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。在肠杆菌科中埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常为阳性。,2.丙二酸盐利用试验,原理：有的细菌可利用丙二酸盐作为唯一碳源，将丙二酸盐分解生成碳酸钠，使培养基变碱。方法：将被检菌接种于丙二酸盐培养基培养基，35培养2448h后观察结果。结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。应用：肠杆菌科中属间及种的鉴别。克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠
12、杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性，其他菌属均为阴性。,四、酶类试验,1.氧化酶试验原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。方法：常用方法有三种；菌落法：直接滴加试剂于被检菌菌落上。滤纸法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上。结果：细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。为保证结果的准确性，分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。应用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。,2.过氧化氢酶试验（触酶试验）,原理方法：取槽置于洁
13、净的试管内或玻片上，然后加3%过氧化氢数滴；或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。结果：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。应用：革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。注意事项3%H2O2溶液要新鲜配制。不宜用血琼脂平板上生长的菌落，因红细胞含有触酶，可致假阳性反应。取对数生长期的细菌。,3.硝酸盐还原试验,原理：在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获
14、得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。方法：被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35培养l4d。将甲（对氨基苯磺酸0.8g+5molL醋酸lOOml）、乙液（-奈胺0.5g + 5mol/L醋酸lOOml）等量混合后（约0.1ml）加入培养基内，立即观察结果。结果：出现红色为阳性。应用：本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌可产生氮气。,4.脂酶试验,原理：有的细菌产生脂酶，可分解脂肪成游离的脂肪酸。从而使培养基中与脂肪结合形成无色化合物的维多利亚蓝释放出来，呈现深蓝色。方法：将被检菌接种于脂酶培养基（含维多利亚蓝）中，于37培养24
15、h结果：培养基变为蓝色为阳性，阴性为粉红色或无色。应用：主要用于厌氧菌的鉴别。类杆菌属中的中间类杆菌产生脂酶，其他类杆菌则阴性；芽胞梭菌属中产芽胞梭菌、肉毒梭菌和诺维梭菌也有此酶，而其他梭菌阴性。,5.卵磷脂酶试验,原理：有的细菌产生卵磷脂酶（-毒素），在钙离子存在时，此酶可迅速分解卵磷脂，生成浑浊沉淀状的甘油酯和水溶性磷酸胆碱。方法：将被检菌划线接种或点种于卵黄琼脂平板上，于35培养36h。结果：若3h后在菌落周围形成乳白色混浊环，即为阳性，6h后混浊环可扩展至56mm。应用：主要用于厌氧菌的鉴定。产气荚膜梭菌、诺维梭菌产生此酶，其他梭菌为阴性。,6.DNA酶试验,原理：某些细菌产生DNA酶
16、，可使长链DNA水解成寡核苷酸链。因为长链DNA可被酸沉淀，寡核苷酸链则溶于酸，所以当在菌落平板上加入酸后，会在菌落周围出现透明环。方法：将被检菌点种于0.2%DNA琼脂平板上，于35培养l824h，然后用lmol/L盐酸覆盖平板，观察结果。结果：在菌落周围出现透明环为阳性，无透明环为阴性。应用：在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌科中沙雷菌和变形杆菌产生此酶，故本试验可用于细菌的鉴别。,7.凝固酶试验,原理方法：1）玻片法：取兔血浆和盐水各一滴，分别置于洁净的玻片上，挑取被检菌分别与血浆和盐水混合。2）试管法：取试管2支，各加0.5ml人或兔血浆，挑取被检菌和阳性对照菌分
17、别加入血浆中并混匀，于37水浴34h。结果：玻片法以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性；试管法以血浆凝固判为阳性。应用：作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。,8.CAMP试验,原理：B群链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的B-溶血素溶解红细胞的活性，因此在两菌（B群链球菌和葡萄球菌）的交界处溶血力增加，出现矢形（半月形）的溶血区。方法：先以产B-溶血素的金黄色葡萄球菌划一横线接种于血琼脂平板上，再将被检菌与前一划线作垂直划线接种，两线不能相交，相距0.5lcm，于37培养1824h，观察结果。每次试验都应设阴性和阳性对照。结果：在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性。应用：在链球菌中，只有B群链球菌CAMP试验阳性，故可作为特异性鉴定,
