细菌的常用生化试验.ppt

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资源描述

1、细菌的常用生化试验,细菌室,23种细菌鉴定常用生化试验,1.碳水化合物的代谢试验(1)糖(醇、苷)类发酵试验(2)氧化一发酵试验(OF试验)(3)-半乳糖苷酶试验(ONPG试验)(4)七叶苷水解试验(5)甲基红试验(6)V-P试验2.蛋白质和氨基酸的代谢试验 (1)明胶液化试验(2)吲哚(靛基质)试验(3)硫化氢试验 )尿素分解试验(5)苯丙氨酸脱氨酶试验(6)氨基酸脱羧酶试验3.碳源和氮源利用试验 (1)枸橼酸盐利用试验(2)丙二酸盐利用试验4.各种酶类试验 (1)氧化酶试验(2)过氧化氢酶试验(触酶试验)(3)硝酸盐还原试验(4)脂酶试验(5)卵磷脂酶试验(6)DNA酶试验(7)凝固酶试验

2、(8)CAMP试验,一、碳水化合物的代谢试验,原理由于细菌各自具有不同的酶系统,对糖的分解能力不同,有的能分解某些糖产生酸和气体,有的虽能分解糖产生酸,但不产生气体,有的则不分解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。具体试验有:糖类发酵试验;葡萄糖代谢类型鉴别试验;七叶苷水解试验;淀粉水解试验;甲基红试验;V-P试验;-半乳糖苷酶试验(ONPG试验)。,1.糖(醇、苷)类发酵试验,原理:由于各种细菌含有发酵不同糖(醇、苷)类的酶,故分解糖类的能力各不相同,细菌分解糖类后的终末产物亦不一致,有的产酸、产气,有的仅产酸,故可利用此特点以鉴别细菌。方法:将分离的纯种细菌,以无菌操作接种到糖(醇、

3、苷)类发酵培养基中,置培养箱中培养数小时至两周后,观察结果。结果:若能分解培养基中的糖(醇、苷)类产酸时,培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡,固体培养基内有裂隙等现象。若不分解,培养基中除有细菌生长外,无任何其他变化。应用:是鉴定细菌最主要和最基本的试验,特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。,2.氧化-发酵试验(0/F试验),原理: 不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同,这种能力因是否有氧气的存在而异,有氧条件下称为氧化,无氧条件下称为发酵。方法:将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基,其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡(或其他矿物油),高度不少于lc

4、m。将培养基于35培养48h或更长。结果:应用:主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别,前者均为发酵型,而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别,前者是发酵型,后者是氧化型。,发酵型(产酸),氧化型,产碱型,3.-半乳糖苷酶试验(ONPG试验),原理 细菌分解乳糖依靠两种酶的作用,一种是半乳糖苷透性酶,它位于细胞膜上,可运送乳糖分子渗入细胞。另一种为-半乳糖苷酶,亦称乳糖酶,位于细胞内,能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。具有上述两种酶的细菌,能在2448h发酵乳糖,而缺乏这两种酶的细菌,不能分解乳糖。方法:从克氏双糖铁培养基上取菌,于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液,加入一滴

5、甲苯并充分振摇,使酶释放。将试管置37水浴5min,加入0.25ml ONPG试剂,水浴20min3h观察结果。结果:菌悬液呈现黄色为阳性反应,一般在2030min内显色。应用:迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性,而不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。,4.七叶苷水解试验,原理方法:将待检菌接种于七叶苷培养基中,培养后观察结果。结果:培养基变为黑色为阳性,不变色者为阴性。应用:主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别,前者阳性,后者阴性。,5.甲基红试验,原理:肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖,在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸,进一步分解中,由于糖代谢的途径不同,可产

6、生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物,可使培养基PH值下降至pH4.5以下,使甲基红指示剂变红。方法:将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中,培养24d,于培养基内加入甲基红试剂,立即观察结果。结果:呈现红色为阳性;橘红色为弱阳性;黄色为阴性。应用:主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌,前者为阳性,后者为阴性。肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性,而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。,6.V-P试验,原理方法:将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中,于35培养48h后加入甲液(6%-萘酚酒精溶液)和乙液(40%KOH溶液),振摇。结果:在数分钟内出现红色为阳性;如无红色出

7、现且于354h后仍如故者即为阴性。应用:本试验常与甲基红试验一起使用,因为前者阳性的细菌,后者通常为阴性。,二、蛋白质和氨基酸的代谢试验,原理:不同种类的细菌分解蛋白质的能力不同。细菌对蛋白质的分解,一般先由胞外酶将复杂的蛋白质分解为短肽(或氨基酸),渗入菌体内,然后再由胞内酶将肽类分解为氨基酸。具体试验有:明胶液化试验;吲哚试验(靛基质试验);硫化氢试验;尿素酶试验;苯丙氨酸脱氨酶试验;氨基酸脱羧酶试验。,1.明胶液化试验,原理方法:将被检菌穿刺接种于明胶培养基,于22培养7d,逐日观察结果。结果:培养基呈液化状态为阳性。应用:肠杆菌科细菌的鉴别,如沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆

8、菌等可液化明胶,而其他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外多数假单胞菌也能液化明胶。,2.吲哚(靛基质)试验,原理方法:将待检菌接种于蛋白胨水培养基中,于35培养2448h,沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。结果:于两者液面接触处出现红色为阳性,无色为阴性。应用:主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,3.硫化氢试验,原理方法:将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基,于35培养2448h观察结果。结果:培养基变黑为阳性,不变为阴性。应用:主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌,绝大多数硫化氢阳性,其他菌属阴性。沙门菌属中也

9、有硫化氢阴性菌种。,4.尿素分解试验,原理方法:将待检菌接种于尿素培养基,于35培养l824h观察结果。结果:培养基呈碱性,使酚红指示剂变红为阳性,不变为阴性。应用:主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性。另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性,而斯氏和产碱普罗威登菌阴性,5.苯丙氨酸脱氨酶试验,原理方法:将被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上,于35培养l824h,滴加10%三氯化铁试剂34滴,自斜面上方流下。结果:出现绿色为阳性。应立即观察结果,延长反应时问会引起褪色。应用:主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性,肠杆

10、菌种中其他细菌均为阴性。,6.氨基酸脱羧酶试验,原理方法:将被检菌分别接种于赖氨酸(或鸟氨酸或精氨酸)培养基和氨基酸对照培养基中,并加入无菌液体石蜡或矿物油,于35培养l4d,每日观察结果。结果:对照管应呈黄色,测定管呈紫色(指示剂为溴甲酚紫)为阳性,若测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现紫色则试验无意义,不能作出判断。应用:主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外,其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外,其他志贺菌均为阴性。,三、碳源和氮源利用试验,1.枸橼酸盐利用试验原理:某些细菌能以铵盐为唯一氮源,并且利用枸橼酸盐作为唯一碳源,可在枸橼酸盐培

11、养基上生长,分解枸橼酸盐,使培养基变碱性。方法:将被检菌接种于枸橼酸盐培养基,于35培养l4d,每日观察结果。结果:培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性;应用:用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。在肠杆菌科中埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性,沙门菌属、克雷伯菌属通常为阳性。,2.丙二酸盐利用试验,原理:有的细菌可利用丙二酸盐作为唯一碳源,将丙二酸盐分解生成碳酸钠,使培养基变碱。方法:将被检菌接种于丙二酸盐培养基培养基,35培养2448h后观察结果。结果:培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性,颜色无变化为阴性。应用:肠杆菌科中属间及种的鉴别。克雷伯菌属为阳性,枸橼酸杆菌属、肠

12、杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性,其他菌属均为阴性。,四、酶类试验,1.氧化酶试验原理:氧化酶(细胞色素氧化酶)是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。方法:常用方法有三种;菌落法:直接滴加试剂于被检菌菌落上。滤纸法:取洁净滤纸一小块,沾取菌少许,然后加试剂。试剂纸片法:将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片,取菌涂于试剂纸上。结果:细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色,为阳性。为保证结果的准确性,分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。应用:主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别,前者为阴性,后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。,2.过氧化氢酶试验(触酶试验),原理方法:取槽置于洁

13、净的试管内或玻片上,然后加3%过氧化氢数滴;或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中,立即观察结果。结果:有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。应用:革兰阳性球菌中,葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶,而链球菌属为阴性,故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。注意事项3%H2O2溶液要新鲜配制。不宜用血琼脂平板上生长的菌落,因红细胞含有触酶,可致假阳性反应。取对数生长期的细菌。,3.硝酸盐还原试验,原理:在合成过程中,硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨,再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物;在分解代谢过程中,硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获

14、得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。方法:被检菌接种于硝酸盐培养基中,于35培养l4d。将甲(对氨基苯磺酸0.8g+5molL醋酸lOOml)、乙液(-奈胺0.5g + 5mol/L醋酸lOOml)等量混合后(约0.1ml)加入培养基内,立即观察结果。结果:出现红色为阳性。应用:本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐;铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌可产生氮气。,4.脂酶试验,原理:有的细菌产生脂酶,可分解脂肪成游离的脂肪酸。从而使培养基中与脂肪结合形成无色化合物的维多利亚蓝释放出来,呈现深蓝色。方法:将被检菌接种于脂酶培养基(含维多利亚蓝)中,于37培养24

15、h结果:培养基变为蓝色为阳性,阴性为粉红色或无色。应用:主要用于厌氧菌的鉴别。类杆菌属中的中间类杆菌产生脂酶,其他类杆菌则阴性;芽胞梭菌属中产芽胞梭菌、肉毒梭菌和诺维梭菌也有此酶,而其他梭菌阴性。,5.卵磷脂酶试验,原理:有的细菌产生卵磷脂酶(-毒素),在钙离子存在时,此酶可迅速分解卵磷脂,生成浑浊沉淀状的甘油酯和水溶性磷酸胆碱。方法:将被检菌划线接种或点种于卵黄琼脂平板上,于35培养36h。结果:若3h后在菌落周围形成乳白色混浊环,即为阳性,6h后混浊环可扩展至56mm。应用:主要用于厌氧菌的鉴定。产气荚膜梭菌、诺维梭菌产生此酶,其他梭菌为阴性。,6.DNA酶试验,原理:某些细菌产生DNA酶

16、,可使长链DNA水解成寡核苷酸链。因为长链DNA可被酸沉淀,寡核苷酸链则溶于酸,所以当在菌落平板上加入酸后,会在菌落周围出现透明环。方法:将被检菌点种于0.2%DNA琼脂平板上,于35培养l824h,然后用lmol/L盐酸覆盖平板,观察结果。结果:在菌落周围出现透明环为阳性,无透明环为阴性。应用:在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶,在肠杆菌科中沙雷菌和变形杆菌产生此酶,故本试验可用于细菌的鉴别。,7.凝固酶试验,原理方法:1)玻片法:取兔血浆和盐水各一滴,分别置于洁净的玻片上,挑取被检菌分别与血浆和盐水混合。2)试管法:取试管2支,各加0.5ml人或兔血浆,挑取被检菌和阳性对照菌分

17、别加入血浆中并混匀,于37水浴34h。结果:玻片法以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性;试管法以血浆凝固判为阳性。应用:作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标,也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。,8.CAMP试验,原理:B群链球菌能产生CAMP因子,可促进葡萄球菌的B-溶血素溶解红细胞的活性,因此在两菌(B群链球菌和葡萄球菌)的交界处溶血力增加,出现矢形(半月形)的溶血区。方法:先以产B-溶血素的金黄色葡萄球菌划一横线接种于血琼脂平板上,再将被检菌与前一划线作垂直划线接种,两线不能相交,相距0.5lcm,于37培养1824h,观察结果。每次试验都应设阴性和阳性对照。结果:在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性。应用:在链球菌中,只有B群链球菌CAMP试验阳性,故可作为特异性鉴定,

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