1、DNA 测序原理和方法 DNA 序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括 Sanger 双脱氧链终止法和 Maxam-Gilbert 化学降解法。自动化测序实际上已成为当今 DNA 序列分析的主流。美国 PE ABI 公司已生产出 373 型、377 型、310 型、3700 和 3100 型等 DNA 测序仪，其中 310 型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是 ABI PRISM 310 型 DNA 测序仪的测序原理和操作规程。【原理】 ABI PRISM 310 型基因分析仪 (即 DNA 测序仪) ，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色
2、荧光染料标记的 ddNTP(标记终止物法) ，因此通过单引物 PCR 测序反应，生成的 PCR 产物则是相差 1 个碱基的 3末端为 4 种不同荧光染料的单链 DNA 混合物，使得四种荧光染料的测序 PCR 产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的 CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在 CCD 摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转
3、变为 DNA 序列，从而达到 DNA 测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定 DNA 片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE 公司还提供凝胶高分子聚合物，包括 DNA 测序胶(POP 6)和 GeneScan 胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh 电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的 CCD 摄影机检测器，使 DNA 测序缩短至 2.5h，P
4、CR 片段大小分析和定量分析为 1040min 。由于该仪器具有 DNA 测序，PCR 片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行 DNA 测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段 PCR、RT-PCR(定量 PCR)等分析，临床上可除进行常规 DNA 测序外，还可进行单核苷酸多态性 (SNP)分析、基因突变检测、 HLA 配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。【试剂与器材】1BigDye 测序反应试剂盒 主要试剂是 BigDye Mix，内含 PE 专利四色荧光标记的 ddNTP 和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymeras
5、e FS，反应缓冲液等。2pGEM-3Zf (+) 双链 DNA 对照模板 0.2g/L，试剂盒配套试剂。3M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2mol/L，即 3.2pmol/l，试剂盒配套试剂。4DNA 测序模板 可以是 PCR 产物、单链 DNA 和质粒 DNA 等。模板浓度应调整在 PCR 反应时取量 1l为宜。本实验测定的质粒 DNA，浓度为 0.2g/L，即 200ng/l。5引物 需根据所要测定的 DNA 片段设计正向或反向引物，配制成 3.2mol/L，即 3.2pmol/l。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如 M13(-21)引物，T7
6、引物等。6灭菌去离子水或三蒸水。70.2ml 或和 0.5ml 的 PCR 管 盖体分离，PE 公司产品。83mol/L 醋酸钠 (pH5.2) 称取 40.8g NaAc3H2O 溶于 70ml 蒸馏水中，冰醋酸调 pH 至 5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。970%乙醇和无水乙醇。10NaAc/乙醇混合液 取 37.5ml 无水乙醇和 2.5ml 3mol/L NaAc 混匀，室温可保存 1 年。11POP 6 测序胶 ABI 产品。12模板抑制试剂(TSR) ABI 产品。1310电泳缓冲液 ABI 产品。14ABI PRISM 310 型全自动 DNA 测序仪。152400 型
7、或 9600 型 PCR 仪。16台式冷冻高速离心机。17台式高速离心机或袖珍离心机。【操作步骤】1PCR 测序反应 (1) 取 0.2ml 的 PCR 管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：所加试剂 测定模板管 标准对照管 BigDye Mix 1l 1l待测的质粒 DNA 1l pGEM-3Zf (+) 双链 DNA 1l待测 DNA 的正向引物 1l M13(-21)引物 1l灭菌去离子水 2l 2l总反应体积 5l，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧 PCR 管，用手指弹管混匀，稍离心。(2) 将 PCR 管置于 9600 或 2400 型 PCR 仪上进行扩增。98变性 2min
8、 后进行 PCR 循环，PCR 循环参数为 96 10s，50 5s，604min，25 个循环，扩增结束后设置 4保温。2醋酸钠/乙醇法纯化 PCR 产物(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到 1.5ml EP 管中。(2) 加入 25l醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上 10min 以沉淀 DNA。12 000r/min 于 4离心 30 min，小心弃上清。(3) 加 70%(V/V)的乙醇 50l洗涤沉淀 2 次。12 000r/min 于 4离心 5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀 1015min。3电泳前测序 PCR 产物的处理。(1) 加入 12l的 TSR 于离心
9、管中，剧烈振荡，让其充分溶解 DNA 沉淀，稍离心。(2) 将溶液转移至盖体分离的 0.2ml PCR 管中，稍离心。(3) 在 PCR 仪上进行热变性 (95 2min)，冰中骤冷，待上机。4上机操作 按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kV 预电泳 5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV ，20min) ，在 7.5kV 下电泳 2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为 2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。5仪器将自动进行序列分析，
10、并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。6测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。【计算】测序反应精确度计算公式：100%差异碱基数( 不包括 N 数)/650100%差异碱基即测定的 DNA 序列与已知标准 DNA 序列比较不同的碱基，N 为仪器不能辨读的碱基。【注意事项与评价】1ABI PRISM 310 基因分析仪是高档精密仪器，需专人操作、管理和维护。2本实验测序 PCR 反应的总体积是 5l，而且未加矿物油覆盖，所以 PCR 管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧 PCR 管盖外，最好选用 PE 公司的 PCR 管。如 PCR
11、结束后 PCR 液小于 44.5l，则此 PCR反应可能失败，不必进行纯化和上样。3作为测序用户来说，只需提供纯化好的 DNA 样品和引物，一个测序 PCR 反应使用的模板不同，需要的 DNA 量也就不同，PCR 测序所需模板的量较少，一般 PCR 产物需 3090ng，单链 DNA 需50100ng，双链 DNA 需 200500ng，DNA 的纯度一般是 A260nm/A280nm 为 1.62.0，最好用去离子水或三蒸水溶解 DNA，不用 TE 缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成 3.2pmol/l 较好。4本实验使用的测序试剂盒是 BigDye 荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测 DNA 长度为 650bp左右。本仪器 DNA 测序精确度为(98.50.5) %，仪器不能辨读的碱基 N2% ，所需测定的长度超过了650bp，则需设计另外的引物。为保证测序更为准确，可设计反向引物对同一模板进行测序，相互印证。对于 N 碱基可进行人工核对，有时可以辨读出来。为提高测序的精确度，根据星号提示位置，可人工分析该处彩色图谱，对该处碱基作进一步核对。
