1、实验六 PCR 产物胶回收实验一、实验目的1. 掌握胶回收的常规操作2. 了解胶回收 PCR 产物的目的二、实验原理利用胶回收试剂盒纯化 PCR 产物。本试剂盒提供一个从 TBE 或 TAE 电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶中提取高质量 DNA 的简单、快速、有效的技术，适合从浓度3% ，高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为 60bp23Kb 的 DNA 片段，小于 100bpDNA 片段回收率为10%55%，0.110kbDNA 片段回收率最大为 99%，大于 10kbDNA 片段回收率为 2070%。回收的基因组 DNA 可以应用到克隆，测序，限制性酶切等各类下游分子生物学实验。三、试剂及配套设备
2、和材料3.1 试剂Extraction buffer Wash buffer Elution buffer3.2 配套设备和材料无菌 1.5ml 离心管 各种规格移液器和无菌移液器吸头无水乙醇 异丙醇 可能需要 3M KAc (pH 5.0) 离心机四、基本技术参数提取方法 操作时间 离心柱溶剂 提取 DNA 片段范围洗脱液回收率样本用量离心柱 16 分钟内完成 2 个样本750ul 60bp23kb 99% 最大 400mg凝胶条适用琼脂糖种类 适用电泳缓冲液 温育温度高/ 低熔点琼脂糖 TAE/TBE 缓冲液 50（低熔点琼脂糖）55（普通琼脂糖）五、操作步骤1. 用干净、锋利的手术刀，将
3、含有目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶切下，并放入 1.5 或2.0 ml 离心管中。请尽量切去不包含 DNA 片段的凝胶。一般情况下，电泳的 DNA 上样量50 ul（50ul 为最终洗脱体积）。2. 按 1：3 的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入 Extraction buffer。例如：100mg 凝胶应加入 300ul Extraction Buffer。对于每人份试剂用量，凝胶质量不能超过 400mg。3. 于恒温水浴或金属浴中 50温育，直到凝胶融化。一般温育时间为 10 分钟，温育过程中没隔 2-3 分钟混匀一次。如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入 10 ul 3M K
4、Ac （pH 5.0），使混合液颜色变回黄色。4. 可选：按 1：1 的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混合均匀。如 DNA 片段大于 500bp/小于 4kb，不需要加异丙醇。5. 将混合液全部转移到 Spin column 内，于 6,000g 离心 1 分钟，并弃去接液管内液体。如混合液体积大于 750ul 可先转移 750ul，其余的液体待离心弃液后，再转移。6. 向 Spin column 内加 500ul Extraction Buffer，于 12，000g 离心 3060 秒，并弃去接液管内液体。7. 向 Spin column 内加 750ul Wash
5、 Buffer，于 12，000g 离心 3060 秒，并弃去接液管内液体。如果回收的 DNA 片段将用于盐浓度敏感的实验，请在加入 Wash buffer 后静置25 分钟，再离心。8. 再次于 12,000 rpm 离心 1 分钟，然后将 spin column 转移到无菌的 1.5ml 离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。9. 向 Spin column 内加 50ul Elution Buffer、水或 TE 溶液，并于室温静置 1 分钟。可根据实验的实际需要决定 Elution Buffer 用量。但不要低于 20ul。10. 于 12，000g 离心 1 分钟，微量离心管内溶液中含有目的 DNA 片段。回收的 DNA 可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20。六、注意事项1. 为了保证没有外源 DNA 的污染，电泳的 buffer 和 gel 都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌。2. 为了减少胶的体积，我们可以用相对比较薄的胶来跑电泳，这样可以减少回收试剂引起的一些后续麻烦。2. 在洗脱前，将洗脱液于 3060温浴，可提高提取效率。七、思考题1. 简述影响 DNA 在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素。2. 简述 PCR 上样缓冲液（ loading buffer）的成分及其作用。
