1、第十七章 生殖毒理学,西安交通大学医学院雷荣辉 ,生殖毒理学的概念,生殖毒理学是研究化学因素及物理因素对男(雄)性和女(雌)性生殖系统有害生物效应的一门毒理学分支科学。生殖毒性可导致男 (雄) 性或女 (雌) 性生殖器官、相关内分泌系统、性周期和性行为以及生育力和妊娠结局的改变。,生殖毒理学的近代史,1950年美国霍普金斯大学医院发现，怀孕期间服用黄体酮，先后有600多名女婴出现生殖器男性化畸形 。1956年用于治疗妊娠反应的反应停，1961年后出现近万例短肢畸形儿(海豹畸形)。1968年日本米糠油事件1999年 比利时发生的二恶英(Dioxins)公害事件。,美国研究人员发现佛罗里达州阿波普
2、卡湖中鳄鱼自从 DDE 泄漏事件后数量急剧减少，繁殖率明显下降，并发现部分雄性鳄鱼血浆中睾酮浓度明显降低、阴茎长度只有正常长度的1/4，且伴有睾丸组织结构的改变等; 雌鳄排出卵中未受精卵的比例显著上升。,2002年7月18日中科院水生生物研究所公布了一项研究成果,东湖部分鱼类因长期遭受污染,出现雄鱼雌性化.,生活污水,洗涤剂,塑料制品,酞酸酯烷基酚类化学物,1992年以来，Carlson等相继报道近50年来成年男子的平均精子数减少近一半,同时男性生殖系统发育异常如隐睾、尿道下裂、睾丸癌等疾患的发病率升高; 女性乳腺癌的发生率近年来每年以1%的速度增长。另外,许多野生动物生殖器官发育异常, 如睾
3、丸和外生殖器变小, 生育力下降。 并认为这些异常改变与环境化学因素有关, 提出了环境雌激素、环境内分泌干扰物等概念。,1996年Theo Colborn等著Our Stolen Future 指出“环境激素” 对人类生存的地球的危害，该书被译成15种语言在世界各地销售。,20个国家男性精子质量调查结果,我国39个县市男性精子质量调查结果,生殖和发育功能障碍是严重影响人体健康的主要公共卫生问题之一。 自发流产率可达全部妊娠中的50% 着床后的自发流产率为32%34% 活产婴儿的主要出生缺陷发生率为3%4% 学龄儿童发育障碍率大约为12%14%。,20世纪妊娠期间暴露己烯雌酚，严重影响子代生殖系统
4、的发育，并使女性后代发生阴道腺癌。,孕妇（围产期） EEs 子代乳腺、子宫、睾丸、前列腺癌,1973年1991年 美国, 41, 24,126,外源化学物对生殖发育损害作用的特点,生殖发育过程较机体其他系统更为敏感；外源化学物对生殖发育过程影响的范围较为广泛和深远。,睾丸副性腺（精囊、前列腺、尿道球腺或称库 柏氏腺（Cowpers腺）管道系统 由输出小管、附睾（由附睾头、附睾体、附睾尾组成）、输精管和射精管组成。,雄性生殖系统,啮齿类动物还有凝固腺和包皮腺两个副性腺,支持细胞 (Sertoli cell)生精细胞,睾丸,曲细精管(约90%), 管壁为生精上皮,间质组织,间质细胞(Leydig
5、cell)供血血管其它细胞,成年睾丸功能的内分泌调控,精原细胞(休止状态) 2n 有丝分裂(青春期)初级精母细胞 2n 减数分裂次级精母细胞 n 精细胞 n,精细胞转变成成熟精子的过程精子生成或精子发生(spermatogenesis),中枢神经系统,下丘脑,垂体,睾丸,附睾,受精,精子发生,GnRH,ICSHFSH,Leydig cell ICSH 睾酮,Sertoli cell FSH ABP,抑制素,调节雄激素含量,雄性生殖系统,精子形成或精子分化(spermiogenesis),卵原细胞(休止状态) 2n 有丝分裂(青春期)初级卵母细胞 2n 减数分裂次级卵母细胞 n 减数分裂 卵细胞
6、 n 成熟卵子,中枢神经系统,下丘脑,垂体,卵巢,颗粒细胞,雌激素,卵子发生,GnRH,LHFSH,黄体细胞 LH 催乳激素孕激素,松驰素 催产素,卵泡膜细胞 LH 雄激素,雌性生殖系统,芳香化酶,女性生殖循环,一、对下丘脑-垂体-性腺轴调控的毒性下丘脑和垂体在睾丸和卵巢功能的调控中发挥综合性作用1.下丘脑 ：内源性阿片样物质是GnRH释放的强抑制剂，外源性吗啡和非麻醉性镇痛剂可抑制GnRH依赖性的LH分泌,滥用麻醉剂这可引起低促性腺激素性性功能不全症。2.垂体毒物既可以直接作用于促性腺物质而改变促性腺激素的合成和分泌，也可间接改变垂体细胞对GnRH或生殖腺类固醇的反应性。（西米替丁、滴滴涕、
7、开蓬、多氯联苯等）,生殖毒作用的靶标与环节,生殖毒作用的靶标与环节,二、对睾丸的毒性1.生精细胞 （白消胺、环磷酰胺、乙二醇等)由于只要存在干细胞，生精上皮就可以再生。单个干细胞基因组中产生的异常性可在配子中被永存。所有干细胞的破坏相当于女性所有卵母细胞的破坏，将产生永久性不育。2. Sertoli细胞：对化学抑制的敏感性居中，数量有限，在维持和调控生精过程，是很多睾丸毒物的靶。 3. leydig细胞：产生的睾酮对Sertoli细胞的功能及性欲和副性腺功能的完整性是非常重要的。,生殖毒作用的靶标与环节,4.影响睾丸的血流和体液平衡：睾丸的血流和体液平衡是睾丸毒物另一个潜在的作用环节。曲细精管
8、自身无脉管系统对缺氧效应敏感。（5-HT或组胺、镉盐等）5.精子排放：指精细胞经过胞核和胞质的转化重组，并从睾丸转运至附睾形成成熟精子的全过程。精细胞的三个功能区均可成为生殖毒物攻击的靶标。精子胞核DNA：氧化乙烯等诱变剂；线粒体和中心粒：能量代谢损伤剂，如-氯乙醇；高尔基体：氧化应激损伤可影响精子的获能和顶体反应过程。,三、对雄性副性腺的毒性1.附睾 附睾是某些生殖毒物的潜在靶，如氯代甲烷2. 输精管和精囊腺前列腺 虽然多种毒物可导致精囊前列腺的大小、重量和分泌活性的降低，但这些效应都是通过干扰雄激素的产生或功能而实现的。一般不会因此而降低生育能力。,生殖毒作用的靶标与环节,生殖毒作用的靶标
9、与环节,四、对卵巢、子宫和阴道的毒性1.生殖细胞 ：所有卵母细胞在雌(女)性出生前就已存在，如果破坏了就没有额外的配子可补偿；最敏感的阶段是卵原细胞的有丝分裂期。2. 颗粒细胞 为卵母细胞正常发育提供所需的激素和营养环境。3. 卵泡膜细胞 具有17羟化酶将孕酮转化为雄烯二酮,生殖毒作用的靶标与环节,毒物对卵巢的毒作用方式：促性腺激素分泌不足、卵泡发育障碍或胆固醇合成障碍均可导致卵巢萎缩，并继发性引起子宫和阴道萎缩； 如可卡因、环磷酰胺、多环芳烃、无机汞等。某些化学物是雌激素和孕酮的拮抗剂或激动剂引起卵巢萎缩；如他莫昔芬、甲氧基醋酸孕酮等。血清促性腺激素水平升高或卵巢胆固醇激素的负反馈调节失灵均
10、可引起排卵周期异常。如外源性LH、FSH催乳素等。,外源化学物对雄性生殖系统的毒作用及其表现,对睾丸的毒性,直接损伤睾丸中的细胞群,对精子发生的有害作用,继发性影响精子发生,改变下丘脑垂体功能,精子生成障碍：Leydig cell 功能异常, 有关激素合成或作用发生改变性欲异常, 阳痿及丧失生育能力引起生殖细胞突变, 造成可遗传损害。,生殖毒作用的靶标与环节,外源化学物对雌性生殖系统的毒作用及表现,对下丘脑垂体系统的损害: 闭经/动情抑制,受孕力降低,对卵巢的损害,卵母细胞数/突变生长卵泡和成熟卵泡 排卵抑制,受孕力卵巢功能提前衰退干扰卵巢内分泌 影响受精/着床/胚胎发育,生殖道的损害: 影响
11、运送卵子/受精/受精卵发育,常见生殖损害的表现,性欲和性交能力,受孕力,月经紊乱,闭经,异常的妊娠结局(流产、早产和死产,子代发育异常,低出生体重,围产期死亡等),生殖毒作用的机理,生殖毒物作用方式,直接作用,间接作用,细胞毒性、致癌或致突变性,结构与内源性分子的相似性,代谢为直接作用的毒物,通过酶的修饰作用, 改变内分泌,生殖毒作用的机理,受体机理,以类似内源性生殖激素的形式通 过膜或细胞受体起作用,下丘脑垂体机理,通过改变由下丘脑或垂体前叶腺 合成和释放的激素,类固醇生成的抑制,酶的抑制,生殖毒作用的分子和细胞机制,一、生殖毒作用的分子机制受体机制：以拟内源性激素的方式，通过细胞膜上或细胞
12、核内受体而引发毒作用，如滴滴涕、开蓬等。影响类固醇合成：药物、激素和化学物可通过干扰或抑制特定的酶而影响类固醇的合成。基因突变与DNA修复：氧化性损伤：生殖毒物可通过氧化应激反应干扰雌雄配子的受精过程。,抑制类固醇生成的物质,生殖毒作用的分子和细胞机制,二、生殖毒作用的细胞机制诱发细胞凋亡：有证据表明在多种睾丸损伤中，细胞凋亡是毒性发生的主要原因，如己二酮、硝基苯和棉酚等。如二恶英、多环芳烃等可诱导卵母细胞凋亡而引发卵巢毒性。干扰细胞连接：如镉、顺铂、棉酚、己二酮等,生殖毒性的检测和评价,一般生殖毒性实验 方法-整体动物试验,一代生殖毒性试验 (single generation reprod
13、uctive toxicity testing) 二代生殖毒性试验 (two generation reproductive toxicity testing) 多代生殖毒性试验 (multigeneration reproductive toxicity testing) I、II、III段生殖毒性试验 (segment I 、II、III reproductive toxicity testing),两性介导的生殖毒性终点,雄性性功能和生育力的特异终点,雌性性功能和生育力的特异终点,体外生殖毒性试验测试方法,Sertoli 细胞原代培养方法Leydig细胞原代培养方法Sertoli细胞/G
14、erm细胞共培养方法附睾上皮细胞与生精细胞共培养方法大鼠精囊上皮细胞培养方法大鼠前列腺上皮细胞培养方法大鼠腹侧前列腺上皮细胞培养方法人精子子宫颈粘膜穿透试验牛子宫颈粘膜人精子穿透试验仓鼠无透明带卵母细胞穿透试验人半透明带试验精子活动度测试试验,雄性生殖毒性体外测试方法,小鼠卵巢多层原始卵泡体外培养方法大鼠卵巢颗粒细胞培养方法人和大鼠黄体细胞培养方法大鼠卵巢灌流培养系统子宫颈上皮细胞体外试验子宫颈粘膜体外毒性试验系统兔乳腺细胞和人乳腺细胞系体外试验方法,雌性生殖毒性体外测试方法,下丘脑垂体毒性的体外方法,垂体前叶(腺垂体)细胞体外试验方法大鼠下丘脑垂体组织连续灌流系统,生殖细胞遗传毒性测试方法,
15、UDS,流式细胞技术, b-dUTP标记法,单细胞凝胶电泳,SCE, 8-OHdG定量检测方法,染色体畸变分析,Southern杂交，FISH分析, FISH分析, 微核试验, 小鼠特异位点试验, 小鼠可遗传异位试验, 显性致死试验,生殖毒性的检测和评价,生殖毒性的评定,外源化学物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行。标准生殖毒性试验可以全面反映外源化学物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断乳后生长发育可能发生的影响。,生殖毒性的评价方法,一 试验原则受试动物：性成熟大鼠、小鼠或家兔 剂量分组：一般设立三个剂量组和一个对照组 高剂量组:能致亲代动物出现
16、轻度中毒，但不出现死亡或死 亡率不超过10%，也不能完全丧失生育能力。 低剂量组的亲代动物不应观察到任何中毒症状。 中间剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。 剂量设置呈等比级数。,动物数：每组雌雄各30只，或至少有20只妊娠；染毒途径：参照人类实际接触途径； 试验期间每周应根据动物体重并参照进食量（大鼠可按每日1520g，小鼠每日510g计算）和要求的摄入剂量（mg/kg体重/日）调整饲料中应混入受试物的数量。应始终保持达到动物应摄入的剂量。,试验方案 :三代两窝生殖实验,Fa,Fb,Fb,Fa,Fa,雄鼠：交配前-11周 雌鼠：交配前2周,第一次交配,第二次交配,观察三个月，喂饲普通饲料，观
17、察其生长发育情况,断乳后给予受试物到11周,观察三个月，喂饲普通饲料，观察其生长发育情况,断乳后给予受试物到11周,观 察 指 标,1受孕率：反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况。 妊娠雌性动物数 受孕率= 100% 交配雌性动物数 2正常分娩率：反映雌性动物妊娠过程是否受到影响。 正常分娩雌性动物数 正常分娩率= 100% 妊娠动物数,3幼仔出生存活率：反映雌性动物分娩过程是否正常，如分娩过程受到影响，则幼仔往往在出生4天内死亡。 出生后4天存活幼仔数 幼仔出生存活率= 100% 分娩时出生幼仔数 4幼仔哺乳成活率：反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力。 21天断奶幼仔存活数 幼仔哺乳成活率= 100% 出生后4天幼仔存活数,还应该注意出生幼仔是否有畸形存在，对死亡的幼仔应进行畸形检查，可为下一步致畸试验提供参考。,
