1、沙眼衣原体检测新进展,杨会林,衣原体Chlamydia,一类能通过细菌滤器，专性真核细胞内寄生，有独特发育周期的微生物；体积略大于病毒，光学显微镜下可见，具有DNA、RNA两种核酸、核糖体和近似细胞壁的膜；以二分裂方式进行增值；能被抗生素抑制，现归于广义的细菌范畴。,沙眼衣原体C. trachomatis,具有特殊发育周期，镜检可观察到两种不同形态结构：1.原体（EB）：存在于细胞外，具有高度感染性2.始体（RB）：存在于细胞内，繁殖型，代谢活泼，无感染性,衣原体分类,按第九版Bergey细菌学分类手册，衣原体分类上属于衣原体目（Chlamydiales）,下有衣原体科（Chlamydicea
2、e）、衣原体属(Chlamydia)。根据衣原体的抗原结构和DNA同源性特点，衣原体分为四个种，包括沙眼衣原体（C. trachomatis）、肺炎衣原体（C.pneumoniae）、鹦鹉热衣原体（C.psittaci）和家畜衣原体（C.pecorum）。前三种对人致病，以沙眼衣原体（CT）常见。,沙眼衣原体C. trachomatis,分A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K、L1、L2、L2a、L3等18个血清型，不同血清型能引起不同疾病。分3个生物型，即小鼠生物型、沙眼生物型和性病淋巴肉芽肿型。后两者与人类疾病相关。,CT抗原结构,属特异性抗原：衣原体胞壁脂多糖（L
3、PS） 识别表位位于2-酮基-3-脱氧辛酸（KDO）三糖 可与肠道菌Re突变株发生交叉反应种特异性抗原：主要外膜蛋白（MOMP），可进行补体结合试验和中和试验检测型特异性抗原：位于MOMP上,沙眼衣原体(CT)感染,感染眼结膜引起沙眼，包涵体结膜炎；沙眼衣原体是性传播疾病的主要病原体。在男性主要引起非淋菌性尿道炎或可合并附睾炎、前列腺炎、性病淋巴肉芽肿等；在女性可引起尿道炎、宫颈炎、输卵管炎、盆腔炎等。严重患者可导致不孕及异位妊娠；能通过性接触或非性接触方式感染新生儿、儿童，引起新生儿肺炎和新生儿包涵体结膜炎，给预防沙眼衣原体感染带来很大困难。,沙眼衣原体(CT)感染,沙眼衣原体感染,沙眼衣原
4、体感染,沙眼衣原体(CT)感染,常与淋病奈瑟菌混合感染（50%）。淋病奈瑟菌对衣原体繁殖起着激活和促进作用。衣原体感染能增加人群获得HIV的概率。最近有研究提出，CT感染能提高患癌症风险。CT感染可破坏p53蛋白，增加突变细胞存活的风险，最终引发癌症。,沙眼衣原体感染流行病学,传播途径：通过性接触传播，母婴垂直传播，接触沙眼患者的毛巾、不洁洗脸水和脸盆传播；在女性宫颈炎和男性尿道感染中，临床上常表现为无症状，呈隐性感染，成为携带者，更易导致感染传播。,沙眼衣原体感染流行病学,据世界卫生组织估计，每年有9200万新发的沙眼衣原体感染病例。在美国，Datta SD 等调查显示，14岁-39岁的群体
5、中，沙眼衣原体的感染率约为4.6%；在欧洲，Redmond S等的一项大规模调查显示，18岁-26岁之间有过性经验的群体中，沙眼衣原体的感染率约为3.6%；Peters R等统计指出，在非洲一些国家的的乡下，女性沙眼衣原体的感染率可达16%以上；,沙眼衣原体感染流行病学,在中国Li CL等于2012年湖北省的一项婚前筛查报告显示，有3.6%的婚前女性感染沙眼衣原体；Chen XS 等2013年一份针对女性性工作者的研究显示，在女性性工作者中，衣原体感染率高达17.3%；有调查统计显示，深圳地区非淋球菌性尿道炎患者中，男性患者沙眼衣原体的检出率为30.57%，女性为21.19%。,沙眼衣原体感染
6、防治,沙眼衣原体对阿奇霉素、强力霉素、喹诺酮类抗生素敏感，确诊后容易治疗。防治沙眼衣原体感染和传播的主要难点在于准确、及时找到病原菌。,CT标本采集及运送,标本采集：1.沙眼及包涵体结膜炎患者：擦净脓性分泌物，用拭子在结膜上穹窿或下穹窿用力涂擦，或取眼结膜刮片；2.泌尿生殖系统感染患者：男性患者用无菌棉拭子插入尿道口2cm出旋转35秒后取出；女性患者选取宫颈移行部位采样。3.小儿肺炎患者：用拭子在鼻咽后部或咽部采集。4.性病肉芽肿标本：采集淋巴结脓汁。标本运送：置于2SP培养基运送，2SP培养基含蔗糖、磷酸盐缓冲液、胎牛血清、抗生素等成分。标本采样后5天内检验，标本应暂存于4。,沙眼衣原体的检
7、测技术,直接涂片镜检：检测包涵体细胞培养抗原检测： 直接荧光抗体测定、酶免疫测定、胶体金法抗体检测核酸检测： 核酸探针检测、PCR、荧光定量PCR、PCR产物直接测序,直接涂片染色镜检,CT寄生于细胞内形成包涵体，通过碘染色或吉姆萨染色可见细胞内包涵体,直接涂片染色镜检,方法学评价：直接涂片染色镜检，操作简便；包涵体的检出对急性、严重的新生儿包涵体性结膜炎的诊断价值大；泌尿生殖道内完整细胞少，细胞内包涵体脆性较大，造成敏感性较低。,细胞培养法,由于CT专性细胞内寄生，可用68天龄鸡胚卵黄囊及各种传代细胞培养。在适宜条件下，将含CT的标本接种于经放线菌酮处理过的单层小鼠成纤维细胞（McCoy）或
8、人宫颈癌细胞（Hela-299），孵育后染色，镜下检测包涵体。,衣原体细胞培养法,细胞培养步骤：制备致密单层细胞。以Hela-299细胞为例，六孔板每孔接种75万细胞，孵育24小时；以30ug/ml DEAE-葡聚糖处理细胞30min，提高细胞膜内吞能力；弃掉DEAE-葡聚糖，换5ml未加血清的培养液，加入菌液。菌液的量要根据菌液浓度而定，过高会造成细胞病变过快，提前大量死亡，过少会造成阳性率过低，无法观察或计数；六孔板3000rpm 1238g 离心。通过物理作用加速促进衣原体进入细胞。有文献报道，通过离心可以提高感染效率100倍；,衣原体细胞培养法,孵箱中孵育两小时，提供衣原体进一步感染的
9、时间，也给细胞一个回复状态的时间。更换感染液：细胞培养液+1g/mL放线菌酮。4872小时碘染色或Giemsa染色或Macchavello染色观察结果。,衣原体细胞培养法,衣原体细胞培养法,特异性100%和敏感性80%90%。被认为是CT检测的“金标准”分离培养操作复杂，技术要求高，所需时间长标本敏感性受标本采集、运送、保存等的影响较大各实验室技术水平不同，标准化难度大多用于科研和临床疑难病例的最终鉴定,胶体金法,胶体金法,衣原体标本预处理后与胶体金标记抗体及二抗结合优点：快速简单，半小时内出结果，易于观察判断；缺点：敏感性低、不能定量检测；不同公司试剂和同一公司试剂批间差异大。,酶免疫测定（
10、EIA）,用ELISA方法，使用酶标记的单克隆或多克隆抗体检测CT的可溶性抗原。常用脂多糖（LPS）单克隆抗体或多克隆抗体进行检测。,酶免疫测定（EIA）,敏感性为64%98%，特异性为93%98%简便。适用于自动化。适于短时间内大批量标本的检测与其它微生物感染偶有交叉反应，如金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌、A群、B群链球菌等。,微量荧光免疫法抗体检测,检测患者血清中有无CT抗体。性病性淋巴肉芽肿、附睾炎、输卵管炎患者血清中CT水平明显升高，该方法有助于诊断。部分患者感染CT后并不产生或仅产生少量抗体，此时检测容易出现假阴性结果。检测重复性差，目前并无统一标准。不建议单独用于CT感染诊断。,直接荧
11、光抗体测定（DFA）,用荧光物标记CT单克隆或多克隆抗体（多为抗沙眼衣原体MOMP单克隆抗体），与相应抗原结合反应，直接进行观察。,直接荧光抗体测定（DFA）,在男性和女性样本中敏感性分别为70%100%和68%100%，特异性分别为87%99%和82%100%；检测快速简便；不像培养法必须有活力的CT。对子宫内膜和输卵管样本，DFA法敏感性高于培养法，且适用于直肠样本；敏感性与特异性取决于单克隆或多克隆抗体；荧光容易淬灭，结果判断有主观性和经验性，不适合于大批量样本检测。,核酸杂交法,用125I标记CT rDNA探针检测宫颈拭子。敏感性与特异性分别为细胞培养法的82.8%和99.4%。用吖啶
12、酯标记单链DNA探针，与标本中 CT rRNA杂交，用化学发光法测定。敏感性与特异性分别为60%93%和95.8% 98.8%。,PCR检测,提取DNA，设计引物及探针，扩增特定DNA片段1.普通PCR：易污染引起假阳性，不能定量检测。2.荧光定量PCR：全闭管扩增系统，避免污染；以参照物为标准，能对拷贝数进行定量分析。,荧光定量PCR检测,PCR检测,特异性高，敏感性好。荧光定量PCR无电泳所致的交叉污染定量检测。目前有研究认为泌尿生殖系统中CT的感染量与患者的临床表现有关。CT定量检测有助于临床诊断与疗效判断。男性可以以尿标本代替传统的尿道拭子，方便收集样本，容易为患者接受。可以设计同一病
13、原体不同DNA片段的二重PCR技术，有效检测某一目的基因发生突变的标本。可以检测不同病原体的二重PCR，如雅培公司CT/NG试剂盒。较传统检测方法通量高，适用于大规模流行病学研究。,EIA、PCR、DFA三种方法比较,PCR产物直接测序,CT MOMP基因经过PCR扩增后，再将PCR产物测序，可以完成对CT的分型检测。单血清型CT感染检测的金标准。适于单血清型CT感染分型检测及大规模流行病学调查。测序方法不适于双重或多重感染。而CT双重或多重感染率为5%15%,CT检测技术的应用,在STI流行病学研究中的应用不同地区，不同人群，CT基因分型不同。瑞典E型（47%）为主，西班牙D型为主（45.3%），深圳F、E、J各占20%左右。澳大利亚女性和男性同性恋：女性E型感染率高于男性（17% vs3%），而D型低于女性（ 7% vs54% ）。CT检测技术即分型技术，有利于CT的防治。CT检测的临床应用 研究发现，E型感染易出现无症状感染；F型和G型下腹痛症状严重。,谢谢！,
