沙眼衣原体检测新进展.pptx

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资源描述

1、沙眼衣原体检测新进展,杨会林,衣原体Chlamydia,一类能通过细菌滤器,专性真核细胞内寄生,有独特发育周期的微生物;体积略大于病毒,光学显微镜下可见,具有DNA、RNA两种核酸、核糖体和近似细胞壁的膜;以二分裂方式进行增值;能被抗生素抑制,现归于广义的细菌范畴。,沙眼衣原体C. trachomatis,具有特殊发育周期,镜检可观察到两种不同形态结构:1.原体(EB):存在于细胞外,具有高度感染性2.始体(RB):存在于细胞内,繁殖型,代谢活泼,无感染性,衣原体分类,按第九版Bergey细菌学分类手册,衣原体分类上属于衣原体目(Chlamydiales),下有衣原体科(Chlamydicea

2、e)、衣原体属(Chlamydia)。根据衣原体的抗原结构和DNA同源性特点,衣原体分为四个种,包括沙眼衣原体(C. trachomatis)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)和家畜衣原体(C.pecorum)。前三种对人致病,以沙眼衣原体(CT)常见。,沙眼衣原体C. trachomatis,分A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K、L1、L2、L2a、L3等18个血清型,不同血清型能引起不同疾病。分3个生物型,即小鼠生物型、沙眼生物型和性病淋巴肉芽肿型。后两者与人类疾病相关。,CT抗原结构,属特异性抗原:衣原体胞壁脂多糖(L

3、PS) 识别表位位于2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)三糖 可与肠道菌Re突变株发生交叉反应种特异性抗原:主要外膜蛋白(MOMP),可进行补体结合试验和中和试验检测型特异性抗原:位于MOMP上,沙眼衣原体(CT)感染,感染眼结膜引起沙眼,包涵体结膜炎;沙眼衣原体是性传播疾病的主要病原体。在男性主要引起非淋菌性尿道炎或可合并附睾炎、前列腺炎、性病淋巴肉芽肿等;在女性可引起尿道炎、宫颈炎、输卵管炎、盆腔炎等。严重患者可导致不孕及异位妊娠;能通过性接触或非性接触方式感染新生儿、儿童,引起新生儿肺炎和新生儿包涵体结膜炎,给预防沙眼衣原体感染带来很大困难。,沙眼衣原体(CT)感染,沙眼衣原体感染,沙眼衣原

4、体感染,沙眼衣原体(CT)感染,常与淋病奈瑟菌混合感染(50%)。淋病奈瑟菌对衣原体繁殖起着激活和促进作用。衣原体感染能增加人群获得HIV的概率。最近有研究提出,CT感染能提高患癌症风险。CT感染可破坏p53蛋白,增加突变细胞存活的风险,最终引发癌症。,沙眼衣原体感染流行病学,传播途径:通过性接触传播,母婴垂直传播,接触沙眼患者的毛巾、不洁洗脸水和脸盆传播;在女性宫颈炎和男性尿道感染中,临床上常表现为无症状,呈隐性感染,成为携带者,更易导致感染传播。,沙眼衣原体感染流行病学,据世界卫生组织估计,每年有9200万新发的沙眼衣原体感染病例。在美国,Datta SD 等调查显示,14岁-39岁的群体

5、中,沙眼衣原体的感染率约为4.6%;在欧洲,Redmond S等的一项大规模调查显示,18岁-26岁之间有过性经验的群体中,沙眼衣原体的感染率约为3.6%;Peters R等统计指出,在非洲一些国家的的乡下,女性沙眼衣原体的感染率可达16%以上;,沙眼衣原体感染流行病学,在中国Li CL等于2012年湖北省的一项婚前筛查报告显示,有3.6%的婚前女性感染沙眼衣原体;Chen XS 等2013年一份针对女性性工作者的研究显示,在女性性工作者中,衣原体感染率高达17.3%;有调查统计显示,深圳地区非淋球菌性尿道炎患者中,男性患者沙眼衣原体的检出率为30.57%,女性为21.19%。,沙眼衣原体感染

6、防治,沙眼衣原体对阿奇霉素、强力霉素、喹诺酮类抗生素敏感,确诊后容易治疗。防治沙眼衣原体感染和传播的主要难点在于准确、及时找到病原菌。,CT标本采集及运送,标本采集:1.沙眼及包涵体结膜炎患者:擦净脓性分泌物,用拭子在结膜上穹窿或下穹窿用力涂擦,或取眼结膜刮片;2.泌尿生殖系统感染患者:男性患者用无菌棉拭子插入尿道口2cm出旋转35秒后取出;女性患者选取宫颈移行部位采样。3.小儿肺炎患者:用拭子在鼻咽后部或咽部采集。4.性病肉芽肿标本:采集淋巴结脓汁。标本运送:置于2SP培养基运送,2SP培养基含蔗糖、磷酸盐缓冲液、胎牛血清、抗生素等成分。标本采样后5天内检验,标本应暂存于4。,沙眼衣原体的检

7、测技术,直接涂片镜检:检测包涵体细胞培养抗原检测: 直接荧光抗体测定、酶免疫测定、胶体金法抗体检测核酸检测: 核酸探针检测、PCR、荧光定量PCR、PCR产物直接测序,直接涂片染色镜检,CT寄生于细胞内形成包涵体,通过碘染色或吉姆萨染色可见细胞内包涵体,直接涂片染色镜检,方法学评价:直接涂片染色镜检,操作简便;包涵体的检出对急性、严重的新生儿包涵体性结膜炎的诊断价值大;泌尿生殖道内完整细胞少,细胞内包涵体脆性较大,造成敏感性较低。,细胞培养法,由于CT专性细胞内寄生,可用68天龄鸡胚卵黄囊及各种传代细胞培养。在适宜条件下,将含CT的标本接种于经放线菌酮处理过的单层小鼠成纤维细胞(McCoy)或

8、人宫颈癌细胞(Hela-299),孵育后染色,镜下检测包涵体。,衣原体细胞培养法,细胞培养步骤:制备致密单层细胞。以Hela-299细胞为例,六孔板每孔接种75万细胞,孵育24小时;以30ug/ml DEAE-葡聚糖处理细胞30min,提高细胞膜内吞能力;弃掉DEAE-葡聚糖,换5ml未加血清的培养液,加入菌液。菌液的量要根据菌液浓度而定,过高会造成细胞病变过快,提前大量死亡,过少会造成阳性率过低,无法观察或计数;六孔板3000rpm 1238g 离心。通过物理作用加速促进衣原体进入细胞。有文献报道,通过离心可以提高感染效率100倍;,衣原体细胞培养法,孵箱中孵育两小时,提供衣原体进一步感染的

9、时间,也给细胞一个回复状态的时间。更换感染液:细胞培养液+1g/mL放线菌酮。4872小时碘染色或Giemsa染色或Macchavello染色观察结果。,衣原体细胞培养法,衣原体细胞培养法,特异性100%和敏感性80%90%。被认为是CT检测的“金标准”分离培养操作复杂,技术要求高,所需时间长标本敏感性受标本采集、运送、保存等的影响较大各实验室技术水平不同,标准化难度大多用于科研和临床疑难病例的最终鉴定,胶体金法,胶体金法,衣原体标本预处理后与胶体金标记抗体及二抗结合优点:快速简单,半小时内出结果,易于观察判断;缺点:敏感性低、不能定量检测;不同公司试剂和同一公司试剂批间差异大。,酶免疫测定(

10、EIA),用ELISA方法,使用酶标记的单克隆或多克隆抗体检测CT的可溶性抗原。常用脂多糖(LPS)单克隆抗体或多克隆抗体进行检测。,酶免疫测定(EIA),敏感性为64%98%,特异性为93%98%简便。适用于自动化。适于短时间内大批量标本的检测与其它微生物感染偶有交叉反应,如金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌、A群、B群链球菌等。,微量荧光免疫法抗体检测,检测患者血清中有无CT抗体。性病性淋巴肉芽肿、附睾炎、输卵管炎患者血清中CT水平明显升高,该方法有助于诊断。部分患者感染CT后并不产生或仅产生少量抗体,此时检测容易出现假阴性结果。检测重复性差,目前并无统一标准。不建议单独用于CT感染诊断。,直接荧

11、光抗体测定(DFA),用荧光物标记CT单克隆或多克隆抗体(多为抗沙眼衣原体MOMP单克隆抗体),与相应抗原结合反应,直接进行观察。,直接荧光抗体测定(DFA),在男性和女性样本中敏感性分别为70%100%和68%100%,特异性分别为87%99%和82%100%;检测快速简便;不像培养法必须有活力的CT。对子宫内膜和输卵管样本,DFA法敏感性高于培养法,且适用于直肠样本;敏感性与特异性取决于单克隆或多克隆抗体;荧光容易淬灭,结果判断有主观性和经验性,不适合于大批量样本检测。,核酸杂交法,用125I标记CT rDNA探针检测宫颈拭子。敏感性与特异性分别为细胞培养法的82.8%和99.4%。用吖啶

12、酯标记单链DNA探针,与标本中 CT rRNA杂交,用化学发光法测定。敏感性与特异性分别为60%93%和95.8% 98.8%。,PCR检测,提取DNA,设计引物及探针,扩增特定DNA片段1.普通PCR:易污染引起假阳性,不能定量检测。2.荧光定量PCR:全闭管扩增系统,避免污染;以参照物为标准,能对拷贝数进行定量分析。,荧光定量PCR检测,PCR检测,特异性高,敏感性好。荧光定量PCR无电泳所致的交叉污染定量检测。目前有研究认为泌尿生殖系统中CT的感染量与患者的临床表现有关。CT定量检测有助于临床诊断与疗效判断。男性可以以尿标本代替传统的尿道拭子,方便收集样本,容易为患者接受。可以设计同一病

13、原体不同DNA片段的二重PCR技术,有效检测某一目的基因发生突变的标本。可以检测不同病原体的二重PCR,如雅培公司CT/NG试剂盒。较传统检测方法通量高,适用于大规模流行病学研究。,EIA、PCR、DFA三种方法比较,PCR产物直接测序,CT MOMP基因经过PCR扩增后,再将PCR产物测序,可以完成对CT的分型检测。单血清型CT感染检测的金标准。适于单血清型CT感染分型检测及大规模流行病学调查。测序方法不适于双重或多重感染。而CT双重或多重感染率为5%15%,CT检测技术的应用,在STI流行病学研究中的应用不同地区,不同人群,CT基因分型不同。瑞典E型(47%)为主,西班牙D型为主(45.3%),深圳F、E、J各占20%左右。澳大利亚女性和男性同性恋:女性E型感染率高于男性(17% vs3%),而D型低于女性( 7% vs54% )。CT检测技术即分型技术,有利于CT的防治。CT检测的临床应用 研究发现,E型感染易出现无症状感染;F型和G型下腹痛症状严重。,谢谢!,

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