1、血清TLR7在类风湿性关节炎发病中的表达及意义Serum levels and significances of Toll-like receptor 7 in rheumatoid arthritis,作 者：郑善翠指导老师：陆亚华苏州大学附属第三医院,研究背景,材料与方法,实验结果,讨 论,结 论,论文内容,类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA）的发病率在我国约为0.4，全球为0.5-1.0，其第一个5年致残率达30，平均缩短寿命57年，已成为一种严重威胁人类健康的疾病。,类风湿性关节炎（RA）是一种慢性进行性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎及对称性关节软骨、骨破坏为
2、主要特征。,自身免疫耐受等,自身免疫性疾病,遗传、环境、感染,关节滑膜炎,软骨和骨破坏,RA,RA发病的确切机制至今尚不清楚，既往研究报道，RA是由T、B淋巴细胞介导的自身免疫性疾病。在此基础上产生了一些针对细胞因子的抑制剂和针对B细胞的单抗类药物，用于治疗RA，并取得了一定的疗效。,但至今尚无一种生物制剂能使ACR70（即治疗6个月后达美国风湿病学会ACR临床改善70%）的缓解率达到50%，并且这些生物制剂往往在终止治疗后不能维持疗效。,此外，研究者发现在免疫缺陷的小鼠中仍然有滑膜成纤维样细胞的活化。这说明除了T、B细胞介导的炎症反应外，还有其他的途径参与了RA的发病过程。,随着Toll样受
3、体（Toll-like receptors，TLRs）的发现，先天性免疫在RA等自身免疫性疾病发病机制中的作用越来越受到研究者的重视。,TLRs是一类模式识别受体，通过识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），激活先天性免疫；TLRs信号还通过上调抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）表面共刺激分子及APC分泌的炎性细胞因子调节适应性免疫。,作为白介素-l受体（interleukin-1 receptor，IL-1R）家族的I型跨膜蛋白， TLRs结构分为3部分：胞外区、跨膜区和胞内区。胞外结构
4、域富含亮氨酸重复基序(1eucine-rich repeats，LRRs)，称为LRRs功能域，主要作用是识别病原体的特征结构PAMPs，该区域结构变异较大，可能与PAMPs存在变异有关。胞内结构域和哺乳类IL-1R的胞内结构非常相似，称为Toll/IL-1R(TIR)功能域，主要负责将获得的信号向下游传导。,研究表明，TLRs过度表达，可激活过强的免疫反应，打破自身免疫耐受导致自身免疫性疾病发生。,正常情况下，机体存在TLRs的负性调节，可以适时终止TLRs信号，避免过强的免疫反应。主要包括5种不同机制：可溶性的TLRs竞争相应配体，如可溶性TLR4、TLR2；通过跨膜负调节分子调节；利用细
5、胞内的负调控分子；下调TLRs的表达；诱导过强细胞的凋亡。,多项研究表明， TLRs参与RA疾病的发生发展。（如TLR2、TLR3、TLR4）。,RA滑膜炎症的持续与加重及单核细胞、淋巴细胞等炎细胞的浸润都依赖于血管床的存在。,血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是迄今为止最强的促血管生长因子，在体内的生物学效应是增加血管通透性和诱导血管形成。其过度表达与类风湿性关节炎的发病及病理变化有着密切联系。,诱导新生血管形成,1,2,3,促进滑膜炎症形成与发展,促进关节软骨和骨破坏,VEGF参与RA病理过程,近年来研究发现，Toll样受体（
6、 Toll-like receptors，TLRs）可以诱导VEGF表达增加（如TLR3、TLR7），由此参与类风湿性关节炎的自身免疫反应过程。,滑膜组织增生,可诱导VEGF表达,作为TLRs家族一员，TLR7主要表达于浆样树突状细胞（plasmacytoid predendritic cell，pDC）、巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等免疫细胞中。此外，TLR7在嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和内皮细胞中也有一定水平的表达。,研究背景,TLR7不仅识别一些咪唑喹啉类似物和鸟苷酸衍生物，更为重要的是识别病毒ssRNA。,国外研究报道，TLR7在类风湿性关节炎滑膜中有异常高表达，并与其他TLRs协
7、同作用，通过MyD88依赖的信号传导通路最终激活NF-B，诱导多种炎性细胞因子、粘附分子及趋化因子的异常表达，打破自身免疫耐受，最终导致RA的关节滑膜炎性病变。,RA发病中，T、B淋巴细胞的激活需要细胞表面TLR7信号的介导。而过度表达的TLR7与IFN-等炎性细胞因子和核因子NF-B 的表达可以形成正反馈循环机制，共同参与RA疾病进展。,国外报道，用低分子量的TLR7激动剂反复给予小鼠刺激，可上调白介素-1受体相关激酶（IRAK）和含有SH2结构域的肌醇-5磷酸酶（SHIP-1），这两种抑制TLRs信号传导的分子表达,并诱导机体对TLR7和其他MyD88依赖信号传导通路的TLRs低反应性甚至
8、免疫耐受，从而抑制RA自身免疫反应。,研究表明：VEGF和细胞表面TLR7均参与RA发病过程。,目前尚无报道的问题：血清TLR7与VEGF表达水平的相关性如何？血清TLR7在RA发病中的表达及意义如何？,RA,通过研究Toll样受体7（TLR7）在胶原诱导关节炎模型（CIA）鼠血清中的表达水平，及其与疾病活动相关性，初步探讨血清TLR7在类风湿性关节炎（RA）发病机制中的作用。,B组：等量生理盐水注射21天,C组：雷公藤多甙50mg/kg/d治疗21天,取DBA小鼠,A组：正常对照组,模型,等量生理盐水注射,皮内注射弗氏完全佐剂，第21天予二次免疫,第二周开始记录各组关节红肿情况，并进行关节炎
9、指数评分(AI),造模后第42天进行取外周血，处死小鼠，取踝关节。,对踝关节进行固定、脱钙、包埋，切片、HE染色，病理学观察。,ELISA法检测血清TLR7、VEGF,关节炎症指数评分,关节病理评分,滑膜组织病理评分,按2mg/ml将牛型胶原加入0.1mol/l冰醋酸溶液中，4过夜。次日加入等体积完全弗氏佐剂充分乳化，得到终浓度1mg/ml的胶原乳剂。距小鼠尾根部2-3cm处给予皮内注射该乳剂（150ul/只），建立类风湿性关节炎鼠模型。将注射当日记为0天，第21天给予等剂量胶原乳剂加强免疫。,建立CIA模型,10%甲醛,10%乙二胺四乙酸,Your Text,脱水 封片,浸蜡(60);包埋,
10、脱蜡至水,统计学处理采用SPSS17.0统计软件包。计量资料用均数标准差的形式表示，组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，重复测量数据通过球性检验，采用双因素重复测量方差分析，变量间关系符合正态分布的采用直线相关性分析，不符合正态分布的采用Spearman秩相关分析，P0.05为差异有统计学意义。,实验结果,初次免疫后14-18天，模型组小鼠开始出现足部及踝关节红肿。至21天，按评分标准衡量，进行造模的20只小鼠，均造模成功。二次免疫后，小鼠关节肿胀逐渐加重，以双侧后足踝关节最明显，关节局部皮肤充血，皮温增高，足垫增厚，小鼠摄食及活动减少，精神萎靡，体重增长缓慢甚至下降。第
11、28天左右关节肿胀达高峰，严重的关节不能负重，少数出现红斑和溃疡，之后关节红肿逐渐减轻。,CIA模型,注：A：小鼠左后肢无明显肿胀，单个关节炎症评分为0分。B：小鼠左前肢轻度红肿，单个关节炎症评分为1分。C：小鼠右后肢均为中度红肿，单个关节炎症评分为2分。D：小鼠左后足严重红肿，单个关节炎症评分为3分。,注：模型组与雷公藤治疗组体重均有一过性降低趋势，分别考虑与严重的关节炎症和药物副作用有关；组间差异有统计学意义（P0.5）。,各组小鼠体重观察记录,注：正常对照组小鼠无明显关节红肿；与模型组相比，雷公藤治疗组小鼠在初次免疫3周后炎症消退较快,但仍有关节红肿，组间差异有统计学意义（P0.05）。
12、,各组关节炎症指数评分记录,表1.各组小鼠关节炎指数评分（AI）记录,注：与雷公藤（TW）治疗组比较，a P0.01；b P0.05。,正常关节结构及滑膜组织。,模型组-滑膜组织血管重度增生，炎症细胞弥漫分布。,模型组-大量增生的滑膜组织和炎症细胞已严重侵蚀关节软骨和骨。,雷公藤治疗组-血管增生及炎症细胞较模型组少，关节软骨和骨侵蚀破坏较模型组轻。,注：模型组较正常对照组降低，组间差异有统计学意义（P0.05，F=1.04）。,注：模型组较正常对照组升高，组间差异有统计学意义（P0.05，F=0.93）。,注：模型组较正常对照组增高，组间差异有统计学意义（P0.01，F=16.33）；雷公藤治
13、疗组较模型组降低，组间差异有统计学意义。,注：模型组较正常对照组增高，组间差异有统计学意义（P0.01，F=16.00）；雷公藤治疗组较模型组降低，组间差异有统计学意义（P0.01，F=0.19）。,注：模型组较正常对照组增高，组间差异有统计学意义（P0.01，F=9.53）；雷公藤治疗组较模型组降低，组间差异有统计学意义（P0.01，F=0.24）。,图7（1）血清TLR7与关节炎指数评分相关性(r=-0.406, P0.05),图7（2）血清TLR7与关节病理评分相关性(r=-0.434, P0.05),图7（3）血清TLR7与滑膜组织病理评分相关性(r=-0.513, P0.01),图7
14、（4）VEGF与关节炎指数评分相关性(r=0.529, P0.01),图7（5）VEGF与关节病理评分相关性(r=0.592, P0.01),图7（6）VEGF与关节滑膜组织病理评分相关性(r=0.578, P0.01),图7（7）血清TLR7与VEGF浓度相关性(r=-0.520, P0.01),讨 论,以往研究着眼于测定细胞表面TLR7的表达及其参与疾病发生的情况。据国外报道， Toll样受体7（TLR7）在RA关节滑膜组织中有过度表达，并可以诱导IFN-、IL-1、IL-18等炎性细胞因子及VEGF、IL-8等促血管形成因子的异常分泌。,本实验主要从血清学角度探讨了TLR7在RA中的表达
15、及意义。,结果发现，CIA模型组血清TLR7异常低表达。模型组有严重的关节炎症和关节病理破坏，雷公藤治疗组较之减轻，组间差异有统计学意义。血清TLR7与关节炎症指数（AI）、关节病理评分及滑膜组织病理评分分别呈负相关。,这一现象的出现，可能是病原入侵后，介导先天性免疫的细胞表面TLR7过度表达，与之竞争配体的血清TLR7可能耗竭殆尽，难以抑制RA自身免疫反应的发生。随着雷公藤的有效治疗，血清TLR7表达可能随之上调，逐渐恢复免疫调控的相互制约状态，从而减缓RA炎症活动。,或许由此可以推测，血清TLR7可能通过负性调节免疫反应机制参与RA的发生或延缓RA的发生，对RA的发展预后可能具有一定的调控
16、作用，甚至有可能成为RA诊断和评估疗效的新指标。,血清TLR7与VEGF呈负相关。而国外有报道，TLR7可以上调VEGF的表达。我们初步推测，血清TLR7可能对VEGF的表达有抑制作用，从而抑制或延缓类风湿关节炎的滑膜炎症和关节病理性破坏。,结 论,血清TLR7在CIA模型组有异常低表达。初步推测，在RA关节滑膜组织增生、血管翳形成、炎症发生乃至关节软骨和骨的病理性破坏过程中，血清TLR7可能具有负性调节作用，有利于抑制或延缓RA发病及病理生理过程。这一发现有助于RA临床诊断，并可能成为其治疗的潜在靶点。,至于血清游离的TLR7与树突状细胞、巨噬细胞、T/B淋巴细胞等免疫细胞表面的TLR7表达水平相关性如何，两者是否存在结构差异；其活化过程如何受到体内外其他因素调节的；与系统性红斑狼疮、干燥综合症等其他自身免疫性疾病相比较，血清TLR7在RA早期患者体内表达水平是否有显著差异，能否成为RA早期诊断的敏感指标之一等等，还需扩大样本，并结合临床资料，开展相关的基础和临床研究，进一步探讨和验证。,THANK YOU!,
