1、细胞培养1,cell culture,细胞培养技术,从生物体内取出组织或细胞，在体外(in vitro)模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于我们观察研究，这种方法就是细胞培养（cell culture）。有时细胞培养也称为组织培养（tissue culture)。,细胞培养目的和用途,1、科学研究 （1）药物研究开发，如新药筛选，疫苗、基因工程药物、细胞工程、药物研究与开发、单克隆抗体制备等（2）基础研究，如药物作用机理、基因功能、疾病发生机理等研究,2、生物制药（1）疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗
2、等)，多肽疫苗（肿瘤疫苗)等 （2）基因工程药物生产：如EPO等（3）抗体药物、基因治疗药物生产（4）细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等 （5）利用细胞法体外测定生物活性物质的活性；并预测其在体内的药效和替代体内法检测其成品的生物活性,主要内容,基本概念准备工作培养用液基本技术污染及防治肿瘤细胞的培养参考资源,基本概念,初代培养（primary culture） 又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物，一般持续1-4周。 一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。传代培养（subculture
3、/passage） 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中,一般情况下可传代10-50次。也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。克隆（clone） 从一个细胞靠有丝分裂获得的一个细胞群体（population） 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株（strain） 再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，称为亚株（Substrain）,cell line: 原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系。如果不断继续传代或传代数有限，可称为有限细胞系（finite cell
4、 line）如果可以连续传代，则可称为连续细胞系（continous cell line）或无限细胞系（Infinite Cell Line）有恶性的无限细胞系：“恶性转化细胞系”只具永生性而无恶性的细胞系：无限细胞系或转化细胞系:NIH3T3、Rat-1,细胞系,细胞株,cell strain: 由原代培养中，用选择或克隆，选出具有特征标记的细胞，经传代形成细胞株。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finite cell strain）如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。,细胞周期,指细胞一个世代所经历的时间从一次细胞分裂结束到下一次
5、分裂结束为一个周期反应细胞增殖速度,体外培养细胞的种类和命名,肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。细胞的命名无严格统一规定，多采用有一定意义缩写字或代号表示几种代表性的细胞名称：HeLa：供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3：美国国立卫生研究所（National Institute of Health）建立； 每3天传代，每次接种3105细胞ml,建立细胞系（或株）的要求,原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织
6、种类等条件稳定即可传代的细胞，需做如下说明：1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物； 个体性别、年龄；取材的器官或组织。 如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。2、细胞生物学检测： 了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。 如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。3、培养条件和方法： 应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。,国内外相关细胞库,国内细胞库武汉细胞库http:/www.cctcc.org/f
7、zlbc/cell.doc 上海细胞库http:/ 昆明细胞库http:/ 成都基因治疗肿瘤药物工程技术研究中心细胞及载体服务http:/ 南京中医药大学新药及海洋药物研究中心药理毒理研究室细胞库目录http:/202.195.210.5/web/keyanziyuan/haiyangcell1.htm湖南远泰生物技术有限公司生物资源库http:/ 上海午立生物技术有限公司细胞株http:/ 中国医学科学院基础医学研究所细胞中心保藏细胞目录http:/ 上海华大天源生物科技有限公司提供高表达GPCR细胞株和报告基因分析细胞系：http:/ 中国工业微生物菌种保藏中心http:/www.chin
8、a-cicc.org/inl%20col/introduction.htm 台湾快兴科技股份有限公司 Cambrex 產品http:/.tw/Cambrex.htm 台湾国家卫生研究院http:/www.nhri.org.tw/index/home2.htm,美国和欧洲细胞库ATCC（细胞株及胚胎干细胞库）1）下载细胞库目录：http:/www.atcc.org/pdf/tcl.pdf2）查询细胞株：http:/www.atcc.org/SearchCatalogs/CellBiology.cfm3）胚胎干细胞库：http:/stemcells.atcc.org/products/cells.
9、cfm CABRI(包括ECACC、DSMZ)http:/www.cabri.org/HyperCat/cells/all.htm CAMBREXhttp:/ 意大利I.A.Z.http:/www.i-a-z-zellkultur.de/haupt_en/cell.html 欧洲细胞实验室列表（大全）http:/www.biotech.ist.unige.it/cldb/labs.html 意大利IZSLER细胞库http:/www.bs.izs.it/cataloghi/cellule/ ABi病毒http:/ 德国PromoCell原代细胞http:/ Type Culture Colle
10、ction (美国标准培养物收集所) ECACC:European Collection of Cell Cultures(欧洲动物细胞库 )JCRB:Japanese Collection of Research Bioresources(日本细胞库) CCTCC:China Center for Type Culture Collection (中国典型培养物保藏中心),ATCC,WHO的国际培养细胞文献中心ATCC液氮冻存有3200个已经过鉴定的细胞系来自正常人和各种疾病患者的皮肤成纤维细胞系来自不同物种的近75个杂交瘤细胞株,ATCC接纳入库细胞时，必须符合其入库标准，检测项目如下：培
11、养简历冻 存 液细胞活力培 养 液细胞形态核 型无污染检测物种检测免疫检测细胞建立者,培养细胞的类型及其特点,培养细胞的生长方式贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。悬浮生长： 于悬浮状态下生长，不需要贴附于支持物表面。包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞，如白血病细胞。,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）,细胞接种后在培养液中呈悬浮状态此时细胞回缩，胞体呈圆球形10分钟4小时,游离期（悬浮期）,细胞附着于底物上，游离期结束。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的糖蛋白（生长基质）
12、，这些促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。,贴壁期,此时细胞有生长活动，而无细胞分裂潜伏期：624小时,潜伏期,细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究,对数生长期,细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止 肿瘤细胞的接触抑制及密度抑制往往减弱
13、或消失，因此细胞可向三维空间发展，导致细胞堆积，并可生长至较高的终末细胞密度。可作为区别正常与癌细胞标志之一。,平台期,1、无污染环境：保证细胞生存的首要条件 2、恒定的温度：36.50.5 3、气体环境 ：95%空气，5%二氧化碳混合气体4、细胞培养基 ：基础物质、生存环境(pH7.2-7.4、渗透压),培养细胞生存条件,培养细胞的生存条件,营养物质糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等,实验准备,实验室设备器材实验器材处理细胞培养用液的配制,实验室设计,准备室（包括配液室）无菌室 ：缓冲间、操作间,设备器材,大型工具类超净工作台CO2培养箱倒置显微镜液氮罐酶标仪、微孔板震荡器消毒灭菌类紫
14、外灯、压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸,配液用具自动双重纯水蒸馏器，纯水仪制备细胞用品耗材：培养瓶，吸管，培养板，冻存管,准备室的设备：,蒸馏器酸缸烤箱高压锅储品柜（放未消毒物品）储品柜（放消毒过的物品）包装台,配液室的设备：扭力天平和电子天平PH计磁力搅拌器,培养室的设备：,液氮罐低温冰箱（-80）CO2孵箱（孵育培养物）二氧化碳缸瓶4冰箱（放serum和培养用液）日光灯和紫外灯储品柜（存放杂物）水浴锅边台（书写实验记录）空气净化器系统三氧消毒杀菌机空调,必须放在无菌间的设备：离心机超净工作台倒置显微镜,压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：用干玻璃器皿消毒（160，2h）滤器：
15、过滤法除菌：大多数培养用液(人工合成培养基、血清、酶液等)超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒,超净工作台,工作原理 利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,滤 器,CO2培养箱,设定条件为37，5CO2 使用时应注意：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气保持培养箱内空气干净。定期消毒箱内灭菌蒸馏水3L蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发,数码型倒置荧光显微镜 CFM-550Z,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,酶标仪 微孔板震荡器,培 养 板,培养
16、瓶,器械的清洗和消毒,实验器材处理,刷洗包装消毒灭菌,玻璃器械洗消,浸泡、刷洗、浸酸、和清洗一、旧的玻璃器皿的洗消1、刷洗、烘干2、泡酸、清洗3、烘干、包装4、高压消毒5、烘干备用,玻璃器械洗消,二、新的玻璃器皿的洗消1、自来水刷洗2、烘干、泡盐酸3、刷洗、烘干4、泡酸、清洗5、烘干、包装6、高压消毒7、烘干备用,金属器械洗消,不能泡酸洗涤剂刷洗自来水冲净75酒精擦拭自来水、蒸馏水冲洗晾干高压烘干备用,橡胶和塑料制品洗消,洗涤剂洗刷 用自来水和蒸馏水冲净 烤箱烘干新的橡胶制品洗涤方法： 0.5mol/L NaOH煮沸30分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸
17、2次，蒸馏水煮沸20分钟，50烤干备用。 塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。 1、针式滤器帽不能泡酸液,用2氢氧化钠泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。2、胶塞烘干后用2氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入稀盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。3、胶帽，离心管帽烘干后只能在2氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净
18、，烘干。然后再泡入稀盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用4、胶头可用75酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。5、其他消毒方法：可用70酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。,注意事项：,1、严格执行高压锅的操作规程：水：防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸2、安装滤膜时注意光面朝上：否则起不到过滤的作用3、注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面C.器皿浸
19、入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底,甲醛薰蒸：,40甲醛溶液，15-30 mlm3，室温2124，相对湿度7585每个房间是7个平方，约20个立方。要甲醛300-600ml，高锰酸钾100-200g 高锰酸钾放入甲醛液体中后，在开始的3秒钟内没有反映，3秒钟以后，会产生大量烟气。所以一旦在甲醛中加了高锰酸钾请马上离开灭菌室，并关上门。 高锰酸钾放入甲醛液体中会使液体沸腾，所以反应要在比较大的大口径容器进行。 甲醛气体毒性非常强，所以操作时一定要带上防毒面具 。,细胞培养用液,细胞培养用液,水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液消化液：胰蛋白酶pH调整
20、液抗生素培养液,平衡盐溶液（BSS）,作用-使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37时，胰酶溶液的作用能力最强使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+ 的BSS，如：D-Hanks液终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用（血清中含有抗蛋白酶成分）,消化液：胰蛋白酶,pH调整液,1、NaHCO3溶液2、HEPES液 是一种弱酸羟乙基哌嗪乙硫磺
21、酸。HEPES对细胞无毒性，可防止pH值迅速变动,培养基,（1）合成培养基：是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖（2）天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长常见使用最为5-20%,天然培养基：,指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限、成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结
22、果的分析、易发生支原体污染,合成培养基:,是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。有一定的配方，是一种理想的培养基。 主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐等在目前常用的培养基中，葡萄糖和谷胺酰胺是体外培养动物细胞的主要能源 优点：标准化生产，组分和含量相对固定、成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）,血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子 激素促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等各种生长因子转移蛋白不明成分支持细胞生长需
23、加 10血清,血清质量好坏是实验成败的关键,常用血清有胎牛、新生牛、小牛、兔、马血清等优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染血清的灭活（消除补体活性）：56，30分钟血清的消毒：过滤除菌,无血清培养基,由基础培养基和替代血清的补充成分组成。1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清,常用细胞培养基,1.MEM(minimum essential media)2.DMEM（Dulbeccos modifi
24、ed Eagle medium)3.IMDM（Iscoves modified Dulbeccos medium）4.RPMI-16405.199细胞培养基系列6.欧氏平衡盐7.F-10,F-12细胞培养基系列8.水解乳蛋白细胞培养基9.其它类型细胞培养基,抗生素的使用,在培养液配制后，培养液内常加适量抗生素，以抑制可能存在的细菌的生长青霉素和链霉素联用庆大霉素：方便、广谱、稳定工作浓度penicillin 100 units/ml streptomycin 100 ug/mlgentamicin 50 ug/ml,完全培养基的组成,基础培养基 80-95血清 5-20碳酸氢钠 2.0 g/L
25、青、链霉素 各100u/ml,细胞培养用液的配制与消毒,一、水的制备：二、PBS的制备与消毒三、胰蛋白酶溶液的配制 因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制。常用的浓度是0.25 ,用滤器过滤除菌四、青、链霉素溶液的配制1、所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。2、具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。3、使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。,RPMI1640培养基的制备,RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌 调节pH值至7.2-7.4 加血清（终浓度 10）,
