1、RNA提取及PCR相关实验技术,RNA提取逆转录实验步骤结果分析PCRqPCR,内容,从RNA提取到基因定性/定量流程,收集并保存组织、血液、细胞等临床样本,样本保存要求最好使用新鲜样品组织：取样离体后，立即分成1cm3左右的小块， 每块约30-100mg，放入冻存管或锡箔纸包好， 立即放置液氮罐中速冻1小时，-80冰箱保存。注意做好标记，避免反复冻融,第一部分 RNA提取,RNA提取样本保存要求,细胞：不建议保存。 培养处理后立即提取RNA， 或收集后，于Trizol液中- 80 保存。血液：不建议长期保存。 或立即分离白细胞后，于Trizol液中 - 80 保存。,试剂耗材准备工作,目的：
2、去除RNase，防止RNA降解 各种离心管、Tip头、冷冻保存管等塑料器皿：浸泡在0.1%的DEPC水中，过夜处理，次日烘干，高压灭菌后再次烘干。 锡箔纸、玻璃匀浆管、研钵、手术剪刀、镊子、移液管等玻璃、金属及陶瓷制品： 用锡箔纸严密包裹后，150高温烘烤4小时。,前期准备工作, RNase-free水：0.1DEPC处理去离子水过夜，次日高压灭菌除去 残留DEPC，分装1.5ml Eppendorf管， 4保存。 75乙醇：用RNase-free水配制，分装为50ml，4保存。 氯仿、异丙醇、无水乙醇：新包装开封后，分装50ml，4保存。注意：DEPC有吸入毒性，需穿工作服，戴手套、口罩操作
3、。,样本准备,组织,50100mg 组织对应1ml Trizol,样本准备,细胞 悬浮细胞：生长对数期诱导后， 5000g，5min离心去 除培养基，收集约5 - 10106个细胞。 每5 - 10106个细胞对应1ml Trizol 贴壁细胞：生长对数期诱导后，收集约5 - 10106个细 胞，倒掉培养基，加入预热PBS洗一次，去 除PBS。 每10cm2培养面积对应1ml Trizol,RNA的提取,注意佩戴口罩、勤更换手套 组织（1）液氮预冷研钵；（2）液氮研磨，至样品呈粉末状（需8-10min）；（3）向研钵内加入1ml Trizol继续研磨，至呈不黏稠液态；（4）将混合液转移至玻璃匀
4、浆器中，冰上匀浆3min；（5）将匀浆液转移至1.5 ml Eppendorf管，室温孵育5min；,裂解,RNA的提取,细胞 悬浮细胞：离心收集后，倒除培养液，加入1ml Trizol 反 复吹打细胞，至溶液不黏稠。 贴壁细胞：倒除培养液，PBS洗涤一次后，直接在培养 瓶或培养板中加入1ml Trizol 反复吹打细胞， 直至溶液不黏稠。室温孵育混合液10min后，转移至1.5 ml Eppendorf管,裂解,Trizol匀浆孵育后,RNA提取优化步骤,（1）对得率较低的样本，可在异丙醇沉淀一步，选用-20 度过夜孵育，以增加得率。（2）对多糖含量较高的样本，可在异丙醇沉淀一步，加入 高盐
5、溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl）， -20度过 夜共孵育，以去除多糖物质的污染。注意：所有试剂均需无酶水配制。,RNA鉴定及初定量,（1）测量OD值得率及纯度检测 得率 总RNA浓度（ug/ml）OD260稀释倍数40ug/ml （通常OD260 数值介于0.15-1.0之间才可靠） 纯度 OD260/280检测RNA纯度 值在1.8-2.1之间，RNA纯度较好； 值小于1.8，表明蛋白杂质较多； 值大于2.2，表明RNA已降解；,RNA鉴定及初定量,（2）琼脂糖凝胶电泳RNA完整性鉴定 13ul RNA溶液上样，1胶，100V电泳10min。完整RNA呈现明显两条带28S，18S
6、，且28S带约为18S带亮度的两倍；有时也可见5S带,RNA鉴定及初定量,Electrophoresis gel of the RNA sample,小结RNA的保护,1. 提取前 1.1 新鲜样品及液氮速冻 1.2 提取工作区RNase的清除 1.3 实验用品RNase的清除 2. 提取中 2.1 组织破碎过程中的保护 2.2 细胞裂解过程中的保护 2.3 实验人员保护措施 2.4 保存过程中,3. 在后续的逆转录过程中仍需保持无酶环境,第二部分 RT-PCR 逆转录PCR,RT-PCR 逆转录, 选择方法： 两步法（适用于多目的基因） 一步法（适用于单一目的基因）,RNA逆转录, 选择逆转
7、录引物：随机引物（适用于低丰度RNA） Oligo (dT)引物（适用于具有Poly A尾的RNA） 特异性引物 （适用于一步法）,RNA逆转录步骤,（1）取1-5ug RNA样本，65热变性10min；（2）配制反应体系，共20ul （以AMV为例）10buffer 2 ulMgcl2 (25mM) 4 uldNTPs (10mM) 2 ulRNase inhibitor(1U/ul) 0.5 ulreverse transcriptase 15 Ureverse primer 0.5 ugRNA sample 1 -5ugRNase-free Water 加至 20 ul,一、逆转录反应,
8、RNA 逆转录步骤,（3）反应体系42孵育60min。如使用随机引物，先室温孵育 10min后，再升温至42。（4）72，5min失活酶，置冰进行后续反应或-20 保存。cDNA第一链已合成，可低温保存或继续后续实验,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以反应底物脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在DNA聚合酶催化下，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。,PCR的原理和反应过程,RT-PCR 逆转录PCR,PCR反应准备工作： 目的基因扩增引物设计：NCBI中查询靶基因的mRNA序
9、列，无特 殊要求可选择CDS序列作为引物设计区域。,RT-PCR 逆转录PCR, mRNA序列查找（以EGFR为例）,RT-PCR 逆转录PCR,以BLAST验证引物,RT-PCR 逆转录PCR,PCR反应准备工作： 选择内参： 1. 受不同实验处理因素时，表达恒定； 2. 在体内各种组织中表达恒定； 3. 除实验设计处理因素之外，能够与目的基因 一起受同等程度的非设计其它因素影响。 常用内参基因名称： -actin、 GAPDH、16Sr、18Sr （Human 、Rat 、 Mouse）,RT-PCR 逆转录步骤,二、PCR扩增（示例）,cDNA第一链 2 ul10PCR buffer(K
10、+) 5 ul25mM MgCl2 3 ul (1.5 mM)10mM dNTPs 1 ul (各200 uM)50M引物 正向/ 反向 各0.5 ul (0.10.5 uM)Taq 酶 0.5 ul (15U)双蒸水 38.5 ul总反应体积： 50 ulPCR mix包含：buffer（Mg2+） dNTPs Taq酶,RT-PCR 逆转录步骤,PCR反应条件95 2 min95 30 sec40-65 10-120 sec22-35cycle72 60-120 sec72 10min12 退火温度：引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度Tm低5左右。两条引物的退火温度相差不应超过4-6
11、。特异性的改进：提高退火温度（比建议退火温度提高2-5）；减少退火时间。过长的退火时间在正常情况下并不能提高产量，只会增加非特异性引物杂交的可能性。,注意事项,（1）每次PCR设立对照组和阴性对照组。（2）科学做法是将内参引物加入目的基因的PCR扩增反应体系中，同时扩增作为对照。（3）将反应体系中的相同试剂预先混合，再分装成各 反应管。（4）设定合适的循环次数，PCR不能进入平台期。（5）在一定范围内调整Mg2+浓度、引物浓度、退火温 度，消除非特异性扩增。,结果鉴定,琼脂糖凝胶电泳分析结果： 2琼脂糖凝胶，取4-8 ul产物上样，60V电泳40min， 紫外灯下观察结果。 采用凝胶图像分析系
12、统，对电泳条带进行密度扫描，测定灰度值。注意：灰度扫描时，选择合适的胶空白区域作为扣除的 背景灰度值。,基因表达的差异分析相对定量,各反应体系以内参基因为参照，计算待测基因产物与其灰度比值，作为待测基因的表达值。即待测基因产物电泳带灰度值内参基因产物电泳带灰度值 双标准曲线法：待测样本基因相对表达量 参照样本基因相对表达量,待测基因相对表达量,结果示例,结果示例,荧光定量PCR (Real-time PCR, qPCR),PCR + 荧光探针/ 荧光染料应用广泛：可用于DNA和RNA的PCR产物定量、基因表达 研究、病原体检测及PCR条件的优化等。可定量原理：经激光激发后荧光量随PCR循环而累
13、积，从而 达到定量目的。无须凝胶电泳：只须反应管内直接检测。减少污染环节：全封闭反应管。 结果重现性好：定量动态范围高达五个数量级。,Real-time PCR,相同模板进行96次扩增的扩增曲线图,起始拷贝数越高，Ct值越小；起始拷贝数越低， Ct值越大,与DNA结合时发光,游离时不发光,一种DNA小沟结合染料,1SYBR Green I,荧光染料,在PCR过程中染料与DNA结合发光,聚合完成,聚合开始,SYBR Green I,每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去染料一结合，就产生荧光信号信号强度与DNA分子总数目成正比,数量关系,一条探针，两条引物 引物位于探针的两边一条探针，
14、两个基团 前边是报告基团，后边是淬灭基团,TaqMan探针/水解探针,每产生一条DNA链，就切断一条探针每切断一条探针，就产生一个单位信号信号强度与结合探针的DNA分子数成正比,数量关系,Real-time PCR反应体系,cDNA第一链 2 ul10M引物 正向/ 反向 各1 ul (0.10.5 uM)2SYBR Green qPCR Mix 10ul 双蒸水 7 ul 总体积 20 ulSYBR Green qPCR Mix包含： SYBR Green 、buffer（Mg2+）、 dNTPs、 Taq酶,Real-time PCR的定量方式,绝对定量：通过定量标准曲线来确定起始模板的拷贝数；相对定量：用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表 达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。结果分析 Ct法：目的基因与管家基因（内参）扩增效率相同或接近 一致时，采用此法。, Ct法,举例： 测定X基因在某因子作用前后的表达变化内参基因：GAPDH ; 实验分实验组和对照组, Ct法,基因表达分析：qPCR实验流程,谢谢！,
