1、细胞计数与细胞增殖,金洁,一、培养细胞的形态观察,体外培养的细胞主要有两种状态。一 种是能贴附在培养支持物上的细胞，如 HeLa 细胞、NH3T3等，叫贴壁型细胞，体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，如 HL60，叫做悬浮型细胞，这类细胞主要是血液原性或癌原性的细胞。,贴壁(粘附)型细胞,粘附:是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在方式基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织， 有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面 才能生存和生长。,培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，
2、因而属于粘附型细胞。粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞,类型 细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同 按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型,分类 根据形态大致的不同，主要2类： 上皮样 成纤维细胞样 其它，不定型,上皮样细胞型,名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于-来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核,生长特点 易相连成片 相靠紧密相连成薄层铺石状 生长
3、时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动,成纤维细胞样细胞,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出23个长短不等的突起 中有卵圆形核,生长特点 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞细胞接触易断开而 单独行动 游离的单独的成纤维样细胞， 常有几个伸长的细胞突起,培养细胞形态不稳定血清 Hela 高血清 低血清 成纤维细胞样 上皮样细胞 pH Hela 太酸或太碱 标准pH 成纤维细胞样 上皮样细胞 细胞密度 3T3 低密度 高密度 成纤
4、维细胞样 上皮样细胞 生长状态改变 悬浮或贴附 悬浮 贴附 圆形 成纤维或上皮样 转化与否 未转化 转化后 成纤维样 可成上皮样,悬浮生长型,概念 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源自血，脾或骨髓， 尤以血中白细胞 癌肿细胞也可能特点 在悬浮中生长良好 细胞圆形，单个或小细胞团,优点 生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞),细胞形态观察,贴壁细胞在生长状态良好时，细胞内颗粒少，看不到有空泡，细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液清澈透明，而当细胞内颗粒较多，
5、透明差，空泡多时，表明生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可能。悬浮细胞当边缘清楚，透明发亮时，生长较好；反之，则较差或已死亡。由于培养基内有 pH 指示剂的存在，因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时问过长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞生长状态不好，或已死亡。,细胞污染,细菌污染真菌污染细菌和真菌的清除支原体污染支原体的清除,细菌污染,细胞培养常见的污染最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混
6、浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。,真菌污染,真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。,!,细菌和真菌的清除,使用抗生素抗生素对杀灭细菌较有效。（当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平）。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。 污染后清除用药需采用大于常用量510倍药物冲洗法，于加药后作用2448小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。,95以上是以下四种支
7、原体：口腔支原体（M.orale）精氨酸支原体（M.arginini）猪鼻支原体（M.hyorhinis）牛莱氏无胆甾原体（A.laidlawii）危害：世界性问题，平均发生率达到11%能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达不能通过可视法对其进行检测对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染来源：操作环境不良操作人员的疏失实验器具不洁等已受污染的细胞已受污染的培养基、血清,支原体污染,荧光染色法电镜检查：扫描电镜、透射电镜支原体培养聚合酶链反应(PCR)法,支原体污染检测,细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓，部分细胞发生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。,支原体污染表现,荧光染料Hoec
8、hst33258染色法检测支原体,荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体,扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体,支原体的清除,支原体清除剂MRA （MycoplasmaRemovalAgent）处理法每4天换一次液，连续处理15天清洗纯化法细胞营养驯化优质细胞群的筛选细胞清洗反复离心洗涤 原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等，氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小的抑制作用。必要时
9、更换所有培养用物。通常，滤过除菌的方法对支原体是没有作用的。 药物辅助高温处理法先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。支原体特异性血清法 用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。,二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定,在细胞生物学的实验中，往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度，是进行实验必不可少的一种基本技能。,1细胞计数,将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。静置3分
10、钟。镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml（4大格细胞总数/ 4）10000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,2细胞活力将细胞悬液以0.5ml加入试管中。加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。,细
11、胞计数时的注意事项消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则会影响细胞计数结果。取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤应注意这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。如细胞团占10%以上，说明消化不充分。细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液时，加液量不要溢出盖片，也不要过少或带气泡。在计数过程中，对大方格的边缘压线细胞应按数上不数下，数左不数右的原则进行计数。染色标本在计数细胞时必须在15分钟内检查计数完毕。因为台盼蓝
12、染液可以将死细胞迅速地染上蓝色，再延长时间则活细胞也将逐渐着色。,细胞增殖实验（MTT法）,(一)原理MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT（噻唑蓝）为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium四唑环开裂，生成蓝色的结晶，结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的结晶可以用DMSO来溶解，利用酶标仪测定570 nm处的光密度
13、OD值，以反映出活细胞数目。,(二)操作（实用于贴壁细胞）1.接种细胞：用含10胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔100010000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul. 2.:培养细胞：同一般培养条件，培养2-3天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3.显色：分别培养不同时间，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。 4.比色：选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸
14、光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。,(三)结果以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线或计算细胞生长抑制率、细胞相对增殖率等。,【注意事项】1.选择适当得细胞接种浓度。边缘孔用无菌PBS填充。2.避免血清干扰：一般选小于10的胎牛血清的培养液进行试验。在显色后尽量吸尽孔内残余培养液。3.设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。每组设定3复孔。4.MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。MTT一般最好现用现配，过滤后4C避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸
15、、锡箔纸包住避光以免分解。 5.酶联免疫检测仪使用前应打开电源预热半小时。6.选择不同的波长，酶联免疫检测仪检测灵敏度不同。应根据实验目的选择相应的波长。7.悬浮细胞先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟。或用cck-8。,CCK-8方法,CCK-8是一种基于WST-8的检测细胞增殖和细胞毒性的方法。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，细胞越少，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。通常96孔板每孔加入10%培养基体积的CCK-8，
16、在细胞培养箱中继续孵育0.5-4个小时，时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，检测波长为450nm。,应用举例,1. MTT实验6孔板接种HCCLM3细胞，1*106每孔，后取1*107病毒每孔加入（LASS2与GFP对照），感染90分钟后，再加入1ml的培养液，24h后，细胞用胰酶消化成细胞悬液，细胞调密度至1000每孔接种96孔平底板，每孔100 ul（边缘孔用无菌PBS填充）。 5%CO2，37孵育24h后，每孔加入20ulMTT（噻唑兰）溶液（5mg/ml），继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入15
17、0ul二甲基亚砜，37孵育15min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。细胞分为3组：LASS2组，GFP组和不加病毒对照组，每组3个复孔，同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）。连续检测6天，OD值绘生长曲线。,结果：LASS2腺病毒感染HCCLM3细胞后，能抑制细胞的生长。采用Students t-test进行统计学分析，差异有显著性（p0.05）。,培养液pH 值变化太快,CO2 张力不对，培养瓶盖拧得太紧，NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足，培养液中盐浓度不正确，细菌、酵母或真菌污染（1）按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.
18、0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5 到10。（2）改用不依赖CO2 培养液。松开瓶盖1/4 圈。加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度。丢弃培养物，或用抗生素除菌。,培养液出现沉淀，但pH值不变,用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来，冰冻保存培养液用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌。将培养液加热到37，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。,培养液出现沉淀， 同时pH 发生变化,细菌或真菌污染丢弃培养物，或用抗生素除菌。,培养细胞不贴壁,胰蛋白酶消化过度，支原体污染，培养液中无贴壁因子缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。分离培养物，检测支原
19、体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。,培养细胞生长减慢,由于更换不同培养液或血清，培养液中一些细胞生长必需成分，如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。培养物中有少量细菌或真菌污染，试剂保存不当。接种细胞起始浓度太低，细胞已老化，支原体污染。比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。增加起始培养细胞浓度。让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培养液。补加谷氨酰胺或生长因子。用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。血清需保存在-5 到-20。培养液需在28避光保存。含血清完全培养液在2-8保存，并在2 周内用完。增加接种细胞起始浓度，换
20、用新的保种细胞。分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。,培养细胞死亡,培养箱内无CO2，培养箱内温度波动太大，细胞冻存或复苏过程中损伤，培养液渗透压不正确，培养液种有毒代谢产物堆积。检测培养箱内CO2检查培养箱内温度取新的保存细胞种检测培养液渗透压。注意：大多数哺乳动物细胞能耐受 渗透压为260 350 mOsm/kg。加入额外试剂如HEPES 或药物都有可能影响培养液渗透压。换入新鲜培养液,Tech tips（一）, 贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，可能在放置几天后颜色变紫。这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢钠导致了pH值的上升。您可以在使用前松
21、开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的pH值（确定松开瓶口以保证气体交换）。 如果细胞培养基偶然被冻，您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。 当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。,Tech tips（二）, 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。 在进行传代培养时，我们强烈推荐进行台盼兰活性记数。研究者常常通过一个简单的稀释（14或12）进行传代，不进行活性检测，您可能接种比你认为的低的多的浓度的细胞，这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长。 在溶解的一周内使用贮存在4冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。,
