1、1,实验室安全与管理 卫检 第2版,第四节 实验室生物安全防护,2,3,第四节 实验室生物安全防护,4,实验室生物安全防护的内容包括安全设备、个体防护装置和措施（一级屏障）；实验室的特殊设计和建设（分区、单向气流）要求（二级屏障）；严格的管理制度和标准化的操作程序及规程（三级屏障）不同生物安全防护等级的实验室其具体要求各不相同。,5,（一）BSL-1实验室,1、针对对象级微生物类别，不引起人或动物疾病的微生物2、基本要求建设选址方面无特殊要求不需要安装生物安全柜等防护设备应能防止昆虫和啮齿动物等进入在可以开启的窗户上安置纱窗应配备消毒设备在靠近实验室出口处设立洗手池地面光滑无缝，台面耐热、耐腐
2、蚀、耐水3、操作规范不需要制订特殊的安全操作规程,如用于教学的普通微生物实验室等。检测 大肠杆菌、枯草杆菌,6,1、针对对象级微生物，公共卫生、临床、医院的诊断实验室2、基本要求除满足BSL-1实验室的全部要求之外配备高压蒸汽灭菌器、化学消毒装置等消毒灭菌设施安装不低于II级的生物安全柜实验室的门能自动关闭实验室应配备洗眼装置、喷淋装置等需制定专门的安全操作规程,（二）BSL-2实验室,如麻疹病毒、 沙门氏菌、乙型肝炎病毒、HIV血清学检测等,7,1、针对对象级微生物、新发传染病和大容量或高浓度的、具有高度气溶胶扩散危险的级微生物2、基本要求除满足BSL-1、2实验室的要求之外独立建筑物或者在
3、建筑物中自成隔离区在主实验室内设置级生物安全柜设置不产生蒸汽的高压灭菌锅或其他消毒装置实验室应明确划分为清洁区、半污染区和污染区安装独立的通风空调系统以控制实验室气流方向和压强梯度实验记录等资料通过传真机等发送至实验室外不得将任何未经消毒灭菌的材料带出实验室制定更加严格的生物安全操作规范,（三）BSL-3实验室,多集中在北京，上海，2004年建成我国首个移动式P3实验,结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、Q热病原体、HIV(血清学检测除外)、立克次氏体等,8,1、针对对象级微生物。实验室隶属于国家或卫生主管机构。2、基本要求除满足BSL-1、2和3级生物安全实验室的要求之外分安全柜型
4、实验室和穿着正压服型实验室安全柜型实验室中所有操作均在级生物安全柜中进行正压服型实验室中工作人员必须穿着特殊的正压服式保护服装设立在独立建筑物内，且该建筑应远离市区制定最严格的操作规范,（四）BSL-4实验室,魔鬼式、全封闭式实验室，全球50个，我国仅中科院武汉病毒研究所有1个，中国农科院哈尔滨兽医研究所，在建中,黄病毒、埃博拉病毒、中欧蜱传脑炎病毒,9,10,BSL-1,BSL-2,BSL-3,正压服型实验室,安全柜型实验室,11,1、ABSL-1适用于饲养大多数经过检疫的储备实验动物(灵长类除外)，以及专门接种了危险度级微生物的动物。要求应用微生物学操作技术规范(GMT) 。2、ABSL-
5、2适用于专门接种了危险度级微生物的动物。,（五）实验动物设施的生物安全防护实验室,12,3、ABSL-3适用于接种危险度级微生物的动物，或根 据危险度评估结果来确定。所有系统、操作和规程每年都需要重新检查及认证。4、ABSL-4适用于接种危险度级微生物的动物，或根 据危险度评估结果来确定。所有系统、操作和规程每年都需要重新检查及认证。,13,动物设施的防护水平的实验操作和安全设备汇总,14,实验室安全设备主要有生物安全柜高压灭菌器离心机负压柔性薄膜隔离装置洗眼器,（一）原理（二）分类及特点 （三）使用要求（四）维护校验,一、生物安全柜biological safety cabinet,BSC,
6、16,（一）原理,利用高效空气过滤器对空气中微小粒子的阻留特性，结合负压环境和专门设计的气体流动模式，实现对危害性生物气溶胶的屏蔽,17,（二）分类及特点,BSC有三个级别， 即BSC-、BSC-（A1、A2、B1、B2）和BSC- 级为密闭袖套操作，其余为前开口操作。,18,BSC-,BSC-级生物安全柜原理图 A 前开口 B 可视窗 C 排风HEPA过滤器 D 压力排风系统特点：为人和环境提供保护，但进入空气未过滤，无法有效保护操作的标本和材料。,19,Al 、A2、 Bl 和 B2 型无菌空气经工作台面，提供个体防护，和台面物品不受污染。可用于操作危险度 级和级的感染性物质在使用正压防护
7、服的条件下， 可用于操作级的感染性物质四种类型区别：排风、气体循环、气流方向等不同,A 前开口；B 可视窗口；C 排风HEPA过滤器；D 后面的压力排风系统；E 送风HEPA过滤器；F 风机,BSC-II,20,BSC-,为负压封闭式操作环境，由一个外置的专门的排风系统控制气流操作人员通过固定在安全柜窗口的橡胶手套，进行工作台面的操作有可灭菌的、装有HEPA过滤排风装置的传递箱与一个双开门的高压灭菌器相连接，并用它来清除进出安全柜的所有物品的污染适用于三级和四级生物安全水平的实验室。用于操作危险度、级生物因子,21,22,1、生物安全柜的安装要求,清洁环境，远离人员、物品流动大的地方。 远离门
8、和窗。 侧面留有30cm的间距。 预留出30-35cm空间连接管道，外接的排气口要比楼层高2米。专用电源,（三）使用要求,23,2、生物安全柜的使用,1.正确安装，确保安全柜与外部排风系统压力平衡，保证安全柜处于正常工作状态。2.定期维护和检测，确保安全性。3.注意保洁，每天做完实验后，清除所有废弃物，再用75%酒精消毒。4.一般滤膜有5-10年使用寿命，在仪器压力表显示压力为50%时候，需更换滤膜。,3、操作规范,1)操作人员:维持生物安全柜开口处气流的完整性。双臂应垂直缓慢进出安全柜。进入后等待约1min，再操作。必需的物品提前置于安全柜内，减少双臂进出次数。2)生物安全柜运行:A1及A2
9、型，不使用时可以关闭。B1和B2型始终保持空气流动以维持房间空气平衡。开始工作前和完成工作后，应运行数分钟排出污染空气。3)物品放置:生物安全柜前后气格栅不被阻挡;安全柜内物品应70%酒精表面消毒;物品应尽可能地放在工作台后部，可产生气溶胶的设备靠后部放置;盛装生物危害性废弃物的物品，放在安全柜内某一侧，不应放在柜外面;工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行。,干净的物品,理想的工作台摆放原则 清洁污染区 在工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行,被污染的区域,废弃物托盘,垃圾袋,4)紫外灯:每周对紫外灯进行清洁，避免灰尘和污垢影响杀菌效果。定期检查紫外线的强度
10、，操作时关闭紫外灯，实验前、后开启20-30min。5)明火:避免使用明火对气流产生影响。用微型燃烧器对接种环灭菌。6)溢出物处理:发生感染性物品溢出时，在安全柜工作状态下，用有效消毒剂立即进行清理，尽可能减少气溶胶的生成。所有接触溢出物品的材料都要进行消毒或高压灭菌。7)保持洁净:在实验结束时，所有物品清除表面污染后移出安全柜。擦拭生物安全柜的内部表面污染。用70%酒精消毒。,8)个人防护:在进行一级和二级生物安全水平的操作时，可穿普通实验服。在进行三级和四级生物安全水平操作时，使用前面加固处理的反背式实验隔离衣。手套应套在隔离衣的外面，可以戴加有松紧带的套袖来保护操作人员的手腕。有些操作还
11、需戴口罩和安全眼镜。9)警报器:生物安全柜采用两种警报方式，窗式警报器提示滑动窗移到适宜的位置；气流警报器表明正常气流模式受到了干扰，立刻停止工作，并通知实验室主管。,28,在进行维护、更换过滤器、性能测试、以及气体消毒以前，应使用消毒剂清除所有内部工作表面和暴露内表面的污染。评估内容：安全柜的完整性、HEPA过滤器的泄漏、向下气流的速度、正面气流的速度、负压/换气次数、气流的烟雾模式以及警报和互锁系统进行测试。还可选择进行漏电、光照度、紫外线强度、噪声水平以及振动性的测试。,（四）维护校验,29,将工作空间用透明聚氯乙烯(PVC)完全包裹起来悬挂在钢架上，隔离装置始终维持负压。入口处的空气经
12、一个HEPA过滤器过滤，出口处经两个HEPA过滤器过滤，可直接将空气排到建筑物外 无生物安全柜的现场，采用柔性薄膜隔离装置来进行高危险生物体(危险度级或级)的操作,二、负压柔性薄膜隔离装置,30,1.实验服、隔离衣、连体衣、围裙2.护目镜、安全眼镜和面罩3.口罩及防毒面具 4.手套5.鞋,P3,P4,31,（一）标本的安全操作1.标本收集 容器坚固，防止意外破损。标本不得超过总体积的50%，无泄漏，外部无残留。粘贴标签，要求或说明书与标本分开放置，并置于防水袋中。2.标本运输 使用可高 压灭菌或耐受化学消毒剂的二级容器，固定标本容器并保持直立运输。3.标本处理 接收大量标本的实验室应安排专门的
13、房间或空间。工作人员了解标本的潜在危害和防护方法，掌握破碎或泄漏容器的处理方法。内层容器需在生物安全柜内打开，并准备好消毒剂。,32,（二）实验室仪器和器具操作1.移液管和移液器,33,2.离心机,离心桶的装载、平衡、密封、打开在安全柜中进行。 每次使用后要及时清除离心桶、转子和离心机腔的污染,34,3.搅拌器、振荡器、混匀器和超声波破碎仪的使用,确认仪器正常运转。建议使用聚四氟乙烯（PTFE）器皿。应有防护装置，有条件在生物安全柜里，覆盖塑料罩操作。在操作结束后，应在生物安全柜里开启容器。使用超声波破碎仪时，应有耳部听力保护装置。,35,4.冰箱,冰箱、低温冰箱和固体干冰盒要定期除霜和清扫。
14、破裂的安瓿、冻存管等要及时清除，应配戴面部保护装置并戴手套，清扫后，进行表面消毒处理。冰箱内容器有清楚的标签（内容物的科学命名、贮存日期和贮存人），无标签及过期材料应高压灭菌后丢弃。对于冰箱内的储存物应有详细的目录。除非有防爆措施，严禁将易燃液体保存在冰箱里，冰箱的门上应张贴这方面的注意事项。,36,5.玻璃器皿和锐器,尽可能用塑料制品代替玻璃制品。用巴斯德塑料吸管代替玻璃吸管减少使用注射器和针头，必须使用时采用锐器安全装置。严禁给用过的针头戴护套。,37,安瓿开启：首先消毒安瓿的外表面，再用砂轮在安瓿外表面的棉塞或纤维塞中部挫一划痕，手里垫一块酒精浸透的棉花再握住安瓿，轻轻地移去安瓿顶部并将
15、其按污染物处理。如果棉塞或纤维塞留在安瓿上，则将其用灭菌镊子除去。向安瓿内缓慢地加入液体以重悬内容物，避免产生泡沫。安瓿储存：不得将装有感染性物品的安瓿侵入液氮，可将感染性物质真空冷冻干燥后超低温保存。从冷藏处取出安瓿时要进行眼睛和手的防护,6. 装有冻干传染性物质安瓿开启与储存,38,(1)血样采集:由受过培训的人员采集，戴手套操作。检验申请单放在防水袋或信封内，不应打开袋子。(2)血清分离:操作人员经过严格培训，操作时戴手套、眼睛和粘膜保护装置。操作中避免或尽量减少气溶胶的产生，不得倾倒。废弃标本管需高压灭菌。操作前应准备相应的消毒剂，用于及时处理喷溅和溢出的标本。(3)涂片、盖玻片、组织
16、及组织切片:用于显微镜观察血液、唾液等标本所使用的载玻片、盖玻片、染色及洗液等废弃物均经消毒液浸泡或高压灭菌后再丢弃。组织标本应用甲醛或多聚甲醛固定，避免冷冻切片。如果必须进行冷冻切片，应当使用安全罩，戴安全防护面罩。清除污染时，仪器温度要求升至室温。,7. 感染性物品操作,39,(4)朊蛋白（prion）相关组织:,朊病毒的抵抗力很强，一旦发生污染清除困难，故操作的实验室应使用专用的设备，不能共享。所有的操作都应在生物安全柜里进行。必须穿一次性的实验室保护服（罩衫和围裙）和戴手套（病理学操作者要在两层橡胶手套之间戴钢网手套）。使用一次性的塑料器皿取代玻璃器皿。不应使用组织处理机，可代之以塑料
17、的广口瓶和大口杯。使用过的钢网手套和Kevlar手套在内的非一次性器械必须灭菌后方可再次使用。朊蛋白对紫外线不敏感，安全柜用甲醛蒸汽处理高效空气过滤器（HEPA）在拆除后应用最低达1000的温度焚烧。,40,（三）个人行为要求个人物品、服装、食品和饮料只应存放于非实验室区域内指定的专用处。实验室内禁止吸烟、喝水、吃东西。禁止在工作区内使用化妆品和处理隐形眼镜。长发应束在脑后。在工作区内不应配戴戒指、耳环、腕表、手镯、项链和其他珠宝,41,（一）不同设备与物品的消毒方法（二）消毒灭菌操作与效果监测（三）实验室废弃物处理要点,42,（一）不同设备与物品的消毒方法1、生物安全柜实验完毕，生物安全柜内
18、所有物品(包括仪器设备)都应进行消毒，并从生物安全柜内取出。用有效氯2000mg/L的含氯消毒剂溶液擦拭台面、内壁和前后面玻璃，保持完全湿润3060分钟。开启紫外线灯照射3060分钟。然后用清水与干净的抹布擦净，以防消毒液腐蚀。消毒完毕，逐一关闭送风和通风设备。更换过滤器（网）前用甲醛进行熏蒸消毒，然后轻轻取下过滤器（网）装入专用密闭包装与容器内，容器外表面消毒后由专车运至指定单位焚烧处理。,43,2、仪器设备局部轻度污染。用有效氯1000-2000mg/L擦拭，保持湿润30-60分钟；贵重或精密仪器用2%戊二醛擦拭30-60分钟（按制造商说明），消毒完毕用清水与干净的布擦净；紧急时对非芽孢污
19、染仪器设备用75%乙醇溶液擦拭三遍。离心管未密闭、试管破裂等液体外溢时。用2%戊二醛擦拭离心机内部，保持湿润至少60分钟（按制造商说明）。有内腔的或严重污染的仪器设备（如受细胞、培养液、体液或血液等污染），整机装入专用密闭包装与容器内，容器外表面消毒后由专车运至指定单位用环氧乙烷消毒。需操作不同的病原微生物前、设备维修前、出现重大污染或意外暴露事故后，应用甲醛或过氧乙酸熏蒸消毒。,44,3、感染性材料与器材使用后丢入专用密闭收集袋与容器内，连同包装与容器一起经压力蒸汽121作用20-30分钟。大的容器表面用有效氯2000mg/L含氯消毒液消毒，保持完全湿润60分钟；如遇细胞、培养液、体液或血液
20、等污染，有效氯含量加大至5000mg/L作用60分钟。4、物体表面用有效氯1000-2000mg/L含氯消毒液擦拭消毒，保持完全湿润3060分钟后用清水去除消毒液残留；如有细胞、培养液、体液或血液等污染，有效氯含量加大至5000mg/L作用60分钟。,45,5、防护用品除防护眼镜与呼吸器外均使用一次性防护用品。每次实验结束后离开实验室前，脱下防护用品进行消毒，有明显污染时随时消毒。一次性防护用品使用后丢入专用密闭收集袋内，经压力蒸汽121作用20-30分钟。防护眼镜在2000mg/L有效氯溶液中浸泡60分钟。呼吸器用环氧乙烷消毒或按制造商提供的方法消毒，消毒后更换呼吸过滤部分。,46,6、检验
21、记录应通过传真机、计算机等手段发送至实验室外。污染的检验原始记录等送出实验室前用压力蒸汽121作用20分钟，快排干燥；大量的检验原始记录等可采用密封包装后外送专业单位进行辐照或环氧乙烷消毒。 7、污水消毒所有实验污水必须经过消毒处理并达到标准后方可排放；污水排放标准参照国家标准医疗机构水污染排放标准（GB18466-2005）执行。,47,8、手的消毒消毒方法。用肥皂流水洗手 12分钟，擦干后用75%乙醇、3000-5000mg/L有效碘溶液或经卫生部批准的手消毒剂消毒手部13分钟，然后用清水冲洗，用自动干手机将手吹干或用消毒纸巾、纱布或毛巾擦干。注意事项。水龙头、皂液与手消毒液均应采用非手触
22、方式。,48,（二）消毒灭菌操作与效果监测1、压力蒸汽灭菌器,物理监测：每次消毒用留点温度计作温度监测并记录作用时间，代表物理参数。化学监测： -每包外用化学指示胶带监测，是否经过灭菌处理； -大包或难消毒物品包，中央用包内化学指示剂监测，根据颜色变化判断是否达到灭菌条件。生物监测： 每月用生物指示剂监测，嗜热脂肪芽孢杆菌（ATCC 7953)生物指示剂，监测后应置56培养2448h后观察。,49,2、紫外线杀菌灯- 操作方法： * 无人条件下用悬吊式或移动式照射，30W，1m处辐照强度70W/cm2，每m3不少于1.5W，照射时间30分钟。- 注意事项： * 保持紫外线灯表面清洁，每两周用酒
23、精棉球擦拭一次 * 室内保持清洁干燥，减少尘埃和水雾，温度低于20或高于40、相对湿度大于60%时应适当延长照射时间； * 紫外线辐照强度低于70% 应及时更换。 - 消毒效果监测： * 每3-6个月测定一次紫外线灯辐照强度。,50,3、化学消毒剂- 操作方法： * 严格按卫生部消毒技术规范中化学消毒剂选用原则、适用范围与注意事项以及试剂说明书、有效期内进行使用 * 做好个人防护。 * 含氯消毒剂使用液应每天配制与更换； * 戊二醛活化后使用液最长使用时间按厂商提供的说明书。- 消毒效果监测： * 用消毒剂浓度试纸测试监测消毒效果。,51,4、甲醛熏蒸法- 操作方法： * 先封闭所有通风口。
24、* 按40ml/m3 比例准备福尔马林用量与等量水，并 按30g/m3的量准备高锰酸钾。 * 先将高锰酸钾倒入容器内加水成糊状，然后将福 尔马林倒入，在温度20以上、相对湿度70%条 件下密闭熏蒸1224小时。 * 消毒完毕，戴好防毒面具进入实验室，通风，然 后用10%的氢氧化铵溶液擦去表面残留。- 消毒效果监测： * 每次消毒用温度计与湿度仪以及化学指示剂监测。 * 用枯草杆菌黑色变种芽孢生物指示剂（ATCC 9372）监测。,52,（三）实验室废弃物处理要点,生物废弃物容器充满量不能超过设计容量，外表面被感染性废物污染时，对被污染处进行消毒处理或加一层包装。所有弃置的实验室生物样本、培养物和被污染的废弃物在从实验室中取走之前，应使其达到生物学安全，常采用高压蒸汽处理。锐器（针头、小刀、金属和玻璃等）直接弃置于防刺破防流失的锐器安全处置容器内，严禁用手盖帽、拆卸、故意弯曲、消毒、毁形等。运送人员从医疗废物产生地点将分类包装的医疗废物按规定时间和路线运送至指定暂时贮存地点。运送医疗废物时，应防止造成包装物或容器破损和医疗废物流失、泄漏和扩散，并防止医疗废物直接接触身体。感染性物质、动物尸体、组织等塑料袋密封运送二级焚烧室（温度至少1000度，彻底焚烧）,53,
